諾氟沙星與氧氟沙星同時與牛血清白蛋白分子作用的熒光光譜

劉保生，閆瀟娜，楊超，張彥青，呂運開

（河北大學化學與環境科學學院藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室，河北保定 071002）

諾氟沙星與氧氟沙星同時與牛血清白蛋白分子作用的熒光光譜

劉保生，閆瀟娜，楊超，張彥青，呂運開

（河北大學化學與環境科學學院藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室，河北保定 071002）

氧氟沙星（OFX）、諾氟沙星（NOR）皆能使牛血清白蛋白（BSA）的熒光猝滅.當2種藥物共存時可進一步使BSA熒光猝滅，借此利用熒光光譜法研究了諾氟沙星、氧氟沙星藥物間的相互作用.研究結果表明2種藥物間存在相互作用，使藥物與蛋白的結合穩定性減小；BSA的熒光猝滅屬于靜態猝滅，藥物與BSA結合位點數n近似為1.依據F?rster能量轉移理論，測定了藥物與蛋白之間的結合距離r，結果表明：藥物間相互作用的存在使r值增大，藥物與蛋白結合穩定性減小.熒光同步光譜研究表明藥物間的相互作用影響了BSA構象，使BSA分子伸展，疏水性降低.

諾氟沙星；氧氟沙星；牛血清白蛋白；熒光光譜；相互作用

血清白蛋白是最重要的藥物分子載體［1］.藥物進入人體后，部分藥物將與血漿中白蛋白發生可逆的結合反應，而只有處于游離態的藥物才可以到達作用部位與受體反應進而產生藥理作用，達到治病的效果.因此，研究藥物與血清蛋白的作用機理，有助于從分子水平上掌握和了解藥物在體內作用過程.諾氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFX）均屬于第3代喹諾酮類抗菌藥［2］.NOR對革蘭氏陰性菌、金黃色葡萄球菌有很強的殺菌作用.OFX通過抑制細菌的DNA旋轉酶和DNA復制而發揮作用，由于其獨特的作用機理，具有抗菌譜廣、抗菌活性強的特點，對革蘭氏陰性菌、陽性菌群均有較強的抗菌作用.NOR［3］，OFX［4］與白蛋白的作用及OFX、環丙沙星同時與白蛋白的作用［5］研究已有報道.已有的BSA與藥物相互作用的研究［6－7］大多是研究一種藥物與蛋白的反應.NOR，OFX屬于同一類藥物，臨床上經常合用，因此研究聯合用藥的藥物間相互影響就顯得尤為重要.本文研究氧氟沙星、諾氟沙星在BSA存在時的相互作用，對臨床上的合理用藥有一定的理論指導意義.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

RF－540型熒光光度計（島津公司）；UV－265型紫外光度計（島津公司）；ZD－2型酸度計（上海雷磁儀器廠）.

諾氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFX）標準品由天津一方科技有限公司提供，質量分數≥99%，均配成1.0× 10－3mol／L的水溶液；牛血清白蛋白（BSA）標準品由Sigma公司提供，質量分數≥99%，配成1.0×10－4mol／L的水溶液，臨用時稀釋；Tris－HCl（Tris：分析純，上海化學試劑采購站經銷；HCl：天津市華東試劑廠）緩沖溶液p H＝7.40，0.1 mol／L NaCl（分析純，秦皇島市化工廠）溶液（用以維持生理條件下的離子強度）.實驗用水均為二次蒸餾水.

1.2 實驗方法

1）于10 m L比色管中準確加入NaCl 1.0 m L，Tris－HCl 2.0 m L，1.0×10－5mol／L的BSA 1.0 m L和不同濃度的NOR或OFX，以水定容，靜置30 min，于λex／λem＝286 nm／340 nm時測定體系的熒光光譜或體系的熒光強度F.

2）于10 m L比色管中準確加入NaCl 1.0 m L，Tris－HCl 2.0 m L，1.0×10－5mol／L的BSA 1.0 m L及1.0×10－5mol／L的NOR（或OFX）溶液1.0 m L，再加不同濃度的OFX（或NOR），用水定容，放置約30 min，測定（條件同上）.

2 結果與討論

2.1 BSA熒光的猝滅

NOR，OFX與BSA及藥物－BSA體系的熒光光譜，見圖1、2，由圖1、2可知，隨藥物濃度的增大，BSA的熒光強度逐漸減小，表明藥物能夠猝滅BSA的熒光［8］.依Stern－Volmer方程［9］F0／F＝1＋K sv［Q］＝1＋Kqτ［Q］（F，F0分別為有、無猝滅劑時的熒光強度；τ≈10－8s為大分子熒光平均壽命；K sv為Stern－Volmer猝滅常數；［Q］為猝滅劑的濃度處理數據，結果見表1.速率猝滅常數K q值遠大于最大擴散碰撞猝滅常數2.0× 1010L／（mol·s），表明熒光猝滅不是由碰撞引起的動態猝滅，而是生成化合物的靜態猝滅［10］.靜態猝滅熒光強度的變化規律lg［（F0－F）／F］＝nlgK＋nlg｛［Q］－（F0－F）［P］／F0｝［11］，其中［P］為BSA總濃度；K為結合常數；n為結合位點數.以lg［（F0－F）／F］對lg｛［Q］－（F0－F）［P］／F0｝作圖，由其斜率、截距，可以求得NOR，OFX與BSA的K及n，列于表1.由表1可知：各體系n≈1；BSA－OFX體系結合常數大于BSA－NOR體系結合常數，表明OFX－BSA體系穩定性比NOR－BSA體系的穩定性要強；固定NOR用量，按實驗方法考察NOR存在時OFX－BSA體系結合常數的變化，發現BSA－NOR－OFX比BSA－OFX體系結合常數小，表明OFX與NOR存在相互作用，作用結果使OFX與BSA的結合能力減弱，即NOR的存在使游離的OFX增加；同理比較BSA－OFX－NOR，BSA－NOR體系結合常數，也表明OFX的存在可以使NOR－BSA的穩定性減弱.體系穩定性減弱表明OFX與NOR共存時，兩者產生的相互作用對藥物藥效有一定程度的影響.

圖1 BSA－OFX體系熒光猝滅光譜Fig.1 Quenching fluorescence spectra of BSA－OFX

圖2 BSA－OFX－NOR熒光光譜 Fig.2 Fluorescence spectra of BSA－OFX－NOR

表1 藥物與BSA的猝滅反應參數Tab.1 Quenching reactive parameters of BSA and drugs

2.2 熒光給體與受體間結合距離的求取

據F?rester能量轉移理論計算能量轉移參數，計算過程見文獻［12］，重疊光譜見圖3.計算結果列于表2.BSA的熒光主要來自其212位色氨酸殘基（Trp）［13］，Trp位于BSA的疏水腔內，r值表示藥物與蛋白結合部位與Trp間的距離.OFX，NOR脂溶性較弱，不易進入疏水腔，結合位置距Trp較遠，因此，其r值比疏水性藥物川穹嗪的r值1.8 nm［14］要大.同時r（BSA－NOR－OFX）＞r（BSA－OFX），表明NOR使BSA－OFX體系穩定性減小，由r（BSA－OFX－NOR）＞r（BSA－NOR）也可得同樣的結論.這也證明2種藥物共存時存在相互作用.

表2 藥物－BSA間E，J，R0，r參數Tab.2 Parameters of E，J，r，R0 between drugs－BSA

圖3 BSA，BSA－OFX的熒光光譜及NOR的吸收光譜Fig.3 Fluorescence for BSA，BSA－OFX and absorbance of NOR

2.3 藥物對BSA構象的影響

對于BSA的同步熒光光譜，固定發射與激發波長差15，60 nm時分別只顯示酪氨酸殘基（Tyr）和色氨酸殘基（Trp）的熒光特性.Trp的發射波長隨Trp所處環境疏水性降低將逐漸紅移，據此可以用來推斷BSA構象的變化［15］，見圖4，紅移數據列于表3.表3數據表明NOR，OFX主要分別影響Trp和Tyr，微環境的變化使BSA腔內疏水性降低，肽鏈的伸展程度有所增加［16］.由圖4比較BSA－NOR－OFX與BSA－OFX體系，進一步證明藥物間存在相互作用.

表3 體系同步熒光光譜位移數據Tab.3 Date of synchronous fluorescence spectra

圖4 BSA－NOR，BSA－OFX－NOR同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence of BSA－NOR and BSA－OFX－NOR

3 結論

實驗表明，利用光譜法，通過研究藥物與BSA間結合參數的變化可以證明諾氟沙星與氧氟沙星間存在相互作用，使得藥物與蛋白的結合穩定性減小，將對藥物在體內的代謝和分布產生重要影響.該方法快速、簡單，能夠為藥物的藥理研究及臨床聯合用藥提供一定的理論依據.

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Studies on the Interaction Between Norfloxacin and Ofloxacin in Presence of Bovine Serum Albumin by Fluorescence Spectrum Methods

LIU Bao－sheng，YAN Xiao－na，YANG Chao，ZHANG Yan－qing，LüYun－kai
（Key Laboratory of Medical Chemistry and Molecular Diagnosis，Ministry of Education，College of Chemistry and Environmental Science，Hebei University，Baoding 071002，China）

Both ofloxacin（OFX）and norfloxacin（NOR）can quench fluorescence of bovine serum albumin（BSA）.The fluorescence will quench further when two drugs coexist.According to this，studies on the interaction between NOR and OFX are established by fluorescence spectrum.Results showed that the interaction between the two drugs could reduce the binding stability of the protein and drug.It confirmed that the quenching mechanism of the combination between BSA and drugs was a static process，and the number of binding sites was 1.Based on the theory of F?rester spectroscopy energy transfer，the binding distance（r＜7.0 nm）between drugs and BSA was obtained.The correlation coefficient and binding distance were increased because of the existence of interaction between drugs.Studies utilizing synchronous spectra showed that the conjugation reaction between drugs and BSA would affect the conformation of BSA.It made protein molecules extend and hydrophobic nature reduce.

norfloxacin；ofloxacin；bovine serum albumin；fluorescence spectra；interaction

O 657.32

A

1000－1565（2011）03－0262－05

2010－10－30

國家自然科學基金資助項目（20675024）；河北省重點基礎研究項目（10967126D）

劉保生（1963－），男，河北保定人，河北大學研究員，主要從事分子光譜研究.

E－mail：lbs＠hbu.edu.cn

梁俊紅）