PGPR芽孢桿菌B－1菌株的鑒定及其應(yīng)用效果

張愛(ài)民，張雙鳳，趙鋼勇，張瑞英

（1.河北大學(xué)生物技術(shù)研究中心，河北保定 071002；2.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

PGPR芽孢桿菌B－1菌株的鑒定及其應(yīng)用效果

張愛(ài)民1，張雙鳳1，趙鋼勇1，張瑞英2

（1.河北大學(xué)生物技術(shù)研究中心，河北保定 071002；2.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

從國(guó)外產(chǎn)品中分離得到一株P(guān)GPR菌株，編號(hào)為B－1；觀(guān)察了該菌株的形態(tài)大小和菌落形態(tài)，進(jìn)行了生理生化反應(yīng)，通過(guò)熱變性法測(cè)定其G＋C（鳥(niǎo)嘌呤－胞嘧啶）摩爾分?jǐn)?shù)為47.2%，鑒定該菌株為短芽孢桿菌（Bacillusbrevis）；通過(guò)小麥水培實(shí)驗(yàn)研究了該菌株對(duì)小麥株高和鮮重的影響，地上部鮮重較對(duì)照增加10.64%，株高較對(duì)照增加6.75%；玉米盆栽實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌株實(shí)驗(yàn)效果優(yōu)于膠質(zhì)芽孢桿菌菌株，株高較對(duì)照增加8.0%，葉面積增加5.6%.

篩選分離；短芽孢桿菌；小麥水培實(shí)驗(yàn)；玉米盆栽實(shí)驗(yàn)

隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，各國(guó)都在積極應(yīng)用和研究無(wú)污染、無(wú)公害的生物肥料，世界上已有70多個(gè)國(guó)家進(jìn)行生物肥料的生產(chǎn).我國(guó)為一農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)業(yè)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位［1］，目前由于農(nóng)民過(guò)度地依賴(lài)化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料，造成有機(jī)肥用量不足，土壤鹽分失調(diào)，土地板結(jié)，土壤質(zhì)地下降，河流和地下水污染等一系列問(wèn)題［2］，影響我國(guó)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展.因此開(kāi)發(fā)和分離篩選新的PGPR微生物肥料菌株［3］，成為廣大微生物科研工作者的責(zé)任.

微生物肥料的應(yīng)用已被證明是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑，是生產(chǎn)綠色食品的重要內(nèi)容，我國(guó)在無(wú)公害蔬菜的生產(chǎn)規(guī)范中已將生物肥料列入推薦用肥.目前微生物肥料在多種作物上得到廣泛應(yīng)用，并取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益［4］.印度Krisnna Bioprodut公司是專(zhuān)業(yè)生產(chǎn)微生物肥料的公司，其產(chǎn)品在印度的許多作物上得到廣泛應(yīng)用，如芒果、水稻、小麥等，并取得了良好的增產(chǎn)效果，糧食作物在5%左右，經(jīng)濟(jì)和水果類(lèi)作物達(dá)到10%以上.

本研究選用的菌株為作者從印度Krisnna Bioprodut公司的生物肥料產(chǎn)品中分離篩選出的一株P(guān)GPR菌株，編號(hào)B－1，通過(guò)形態(tài)觀(guān)察和生理生化反應(yīng)，對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定；通過(guò)小麥水培實(shí)驗(yàn)和玉米盆栽實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)小麥和玉米的促生作用優(yōu)于膠質(zhì)芽孢桿菌菌株［5］，而膠質(zhì)芽孢桿菌作為生產(chǎn)菌株在我國(guó)的很多肥料生產(chǎn)企業(yè)中已經(jīng)國(guó)家農(nóng)業(yè)部進(jìn)行了登記，并在多種作物上取得了很好的增產(chǎn)作用［5］.因而，本研究為所分離的菌株作為微生物肥料生產(chǎn)菌株提供了理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 菌種來(lái)源

從印度Krisnna Bioproduct公司的產(chǎn)品中分離.

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 分離培養(yǎng)基

牛肉膏5.0 g／L，蛋白胨10.0 g／L，NaCl 5.0 g／L.

1.2.2 生孢培養(yǎng)基

蛋白胨0.7 g，牛肉膏5 g，酵母膏1 g，MnSO4·H2O 50 mg，蒸餾水1 000 m L，瓊脂18 g.

1.3 方法

1.3.1 菌株分離方法

取Krisnna Bioproduct公司的產(chǎn)品10 g，無(wú)菌操作放入100 m L帶有玻璃珠的無(wú)菌水中，在康氏振蕩器上振蕩40 min，然后100℃水浴3 min，采用稀釋平板法稀釋到0.001 g／L，取0.1 m L涂布在分離培養(yǎng)基平板上［5］，30℃培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行結(jié)果觀(guān)察和挑取菌落，記作B－1，并保存在生孢培養(yǎng)基斜面上.

1.3.2 菌株鑒定方法

1.3.2.1 菌體形態(tài)和菌落形態(tài)觀(guān)察 在B－1保存菌株斜面上挑取菌苔少許，涂在載玻片上，染色后觀(guān)察菌體形態(tài)；將B－1保存菌株在分離培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)，觀(guān)察單個(gè)菌落的形態(tài)特征.

1.3.2.2 生理生化鑒定 依據(jù)一般細(xì)菌的鑒定方法進(jìn)行過(guò)氧化氫酶活性、需氧性、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)（V.P.實(shí)驗(yàn)）、碳水化合物產(chǎn)酸（包括從葡萄糖產(chǎn)氣）、酪素水解、淀粉水解、酪氨酸水解、檸檬酸鹽和丙酸鹽的利用、硝酸鹽還原、生長(zhǎng)溫度和耐鹽性的測(cè)定.

1.3.2.3 G＋C（鳥(niǎo)嘌呤－胞嘧啶）摩爾分?jǐn)?shù)的測(cè)定 采用溫度熱變性法［6］測(cè)定.

1.4 小麥水培實(shí)驗(yàn)

采用平皿濾紙培養(yǎng)法，以膠質(zhì)芽孢桿菌作為對(duì)照菌株，每皿均勻擺放25粒種子，按照每粒種子表面接種的菌數(shù)為106的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，設(shè)3個(gè)處理，4次重復(fù)，處理1：B1菌株；處理2：膠質(zhì)芽孢桿菌菌株；處理3：清水對(duì)照.室內(nèi)光照培養(yǎng)，每天10 h光照，20 h暗培養(yǎng)，隨機(jī)排列.35 d后進(jìn)行調(diào)查和結(jié)果分析.

1.5 玉米盆栽實(shí)驗(yàn)

挑選大小一致的花盆9個(gè)，每盆裝1.75 kg土，分3層裝入花盆，分別壓實(shí)，定植玉米種子，每盆8粒，在每粒種子表面點(diǎn)加0.2 m L菌液或水，最后表面覆蓋0.75 kg土，壓實(shí).本實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，3次重復(fù)，隨機(jī)排列.處理1：B－1菌株；處理2：膠質(zhì)芽孢桿菌菌株；處理3：清水對(duì)照.

將所有花盆放在通風(fēng)良好、光照均勻處，種子發(fā)芽前2天澆1次水，每盆200 mL左右，水量要求一致.進(jìn)入玉米苗期后，每天澆水1次.待幼苗長(zhǎng)至第1片葉展開(kāi)后，進(jìn)行疏苗，選取長(zhǎng)勢(shì)相近的幼苗，每盆留苗6株，本實(shí)驗(yàn)周期為55 d，測(cè)定項(xiàng)目為玉米的株高和葉面積.玉米植株株高的測(cè)定方法為測(cè)量從根與莖的結(jié)合部到最高葉片的頂端，玉米葉面積測(cè)定方法為測(cè)量第4葉的長(zhǎng)度和寬度（最寬處），依據(jù)長(zhǎng)度和寬度的乘積計(jì)算葉面積.

2 結(jié)果和討論

2.1 B－1菌株的菌體形態(tài)和菌落形態(tài)

B－1菌在肉湯平板上生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)體早期為兩聯(lián)，隨后斷落為單個(gè)菌體.單個(gè)菌體形態(tài)為細(xì)桿狀，營(yíng)養(yǎng)體中后期，中部開(kāi)始膨大，呈紡錘狀，芽孢在膨大部位形成，由小變大，形成孢子囊，孢子囊脫落釋放出芽孢，整個(gè)過(guò)程48 h完成.B－1菌株革蘭氏染色結(jié)果為可變，大小為（2.5～4.0）μm×（0.6～0.9）μm.B－1菌株在肉湯平板上菌落形態(tài)為表面有金屬光澤，邊緣整齊，灰白色，微凸起，圓形，不透明，培養(yǎng)48 h，直徑2～5 mm.結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2.

圖1 B－1菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Shape of B－1 clony

圖2 B－1菌株的菌體和芽孢形態(tài) Fig.2 Shape of B－1 cell and spore

2.2 B－1菌株的生理生化反應(yīng)

B－1菌株的14項(xiàng)生理生化反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 B－1菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of physiological and biology－chemical reaction

2.3 G＋C摩爾分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果

采用溫度熱變性法，以標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌（E.coli.K12）為參比菌株，測(cè)定B－1菌株的G＋C摩爾分?jǐn)?shù)，大腸桿菌K12菌株的tm值為74.9℃，B－1菌株的tm值為74.2℃，依據(jù)G＋C摩爾分?jǐn)?shù)＝（tm－53.9）／0.41經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算，E.coli.K12菌株的G＋C摩爾分?jǐn)?shù)為51.2%，B－1菌株的G＋C摩爾分?jǐn)?shù)為47.2%，見(jiàn)圖3和圖4.

2.4 鑒定結(jié)果

參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)［7］和CRC微生物手冊(cè)［8］，依據(jù)B－1菌株的菌體形態(tài)特征和菌落形態(tài)，并參照其生理生化反應(yīng)和G＋C摩爾分?jǐn)?shù)，將該菌株鑒定為短芽孢桿菌（Bacillusbrevis）.

圖3 E.coli K12菌株溫度熱變性曲線(xiàn)Fig.3 Curve of thermal denaturation of E.coli K12

圖4 B.brevis B－1菌株溫度熱變性曲線(xiàn)Fig.4 Curve of thermal denaturation of B.brevis B－1

2.5 小麥水培實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小麥定植后，生長(zhǎng)35 d后，將植株和麥粒用剪刀剪開(kāi)，測(cè)定地上部分鮮重，并且從每皿中取出10株測(cè)定植株的高度，結(jié)果見(jiàn)表2，3.

表2 小麥植株地上部鮮重測(cè)定結(jié)果Tab.2 Result of f resh weight of wheat stem and leaf

表3 小麥植株株高測(cè)定結(jié)果Tab.3 Result of wheat height

從表2和表3可以看出，本研究新分離的B－1菌株和膠質(zhì)芽孢桿菌均對(duì)小麥的生長(zhǎng)發(fā)育具有刺激作用，地上部分鮮重膠質(zhì)芽孢桿菌較對(duì)照增加1.10%，B－1菌株較對(duì)照增加10.64%；株高B－1菌株較對(duì)照增加6.75%，說(shuō)明新分離的B－1菌株可以提高小麥的株高和地上部分鮮重，對(duì)小麥的生長(zhǎng)發(fā)育具有刺激作用.

2.6 玉米盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6株玉米的葉面積測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 玉米葉面積Tab.4 Maize leaf area cm2

從表4看出，接種B－1菌株和膠質(zhì)芽孢桿菌均能促進(jìn)玉米生長(zhǎng)發(fā)育，B－1菌株葉面積較對(duì)照增加5.6%.盆栽玉米實(shí)驗(yàn)進(jìn)行苗期調(diào)查，株高結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 玉米株高Tab.5 Maize plant height cm

玉米接種B－1菌株和膠質(zhì)芽孢桿菌平均株高均較對(duì)照高，B－1菌株較對(duì)照增加8.0%，而膠質(zhì)芽孢桿菌較對(duì)照增加1.7%.

3 結(jié)論

1）通過(guò)菌體和菌落形態(tài)觀(guān)察及相關(guān)生理生化實(shí)驗(yàn)，依據(jù)伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)，鑒定從印度Krishna Bioproduct產(chǎn)品分離的B－1菌株為短芽孢桿菌.

2）B－1菌株具有促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育之功效，小麥水培實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為小麥植株株高和鮮重均比對(duì)照和參比菌株增長(zhǎng)效果明顯，株高較對(duì)照增加6.75%，鮮重較對(duì)照增加10.64%；玉米盆栽實(shí)驗(yàn)證實(shí)玉米接種B－1菌株和膠質(zhì)芽孢桿菌均能促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育，而B(niǎo)－1菌株優(yōu)于膠質(zhì)芽孢桿菌菌株，葉面積較對(duì)照增加5.6%，株高增加8.0%.

3）菌株的代謝產(chǎn)物及其增產(chǎn)機(jī)理有待進(jìn)一步探索.

4）B－1菌株的作物應(yīng)用試驗(yàn)有待進(jìn)一步擴(kuò)大.

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［8］AILLEN I L，HUBERT A L.CRC handbook of microbiology［M］.2nd.cleveland：CRC Press，1977：319－334.

Applied Effects and the Identification of PGPRBacillusB－1 Strain

ZHANG Ai－min1，ZHANG Shuang－feng1，ZHAO Gang－yong1，ZHANG Rui－ying2
（1.Center of Biological Technology，Hebei University，Baoding 071002，China；2.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

A PGPR strain named B－1 was separated from foreign products，the morphology of the cell and the clony was observed and physiological and biology－chemical reaction were made.DNA G＋C mol% was 47.2%by the method of thermal denaturation，so the strain was identified asBacillusbrevis；The height and the fresh weight was studied by the experiments of wheat inoculated with it.The fresh weight of wheat was increased by 10.64%and the plant height was increased by 6.75%.The maize pot experiment results showed that significant increasing effect could be got，plant height and leaf area could be increased than that of the control andBacillusmucilaginosus.Maize plant height could be increased by 8.0%and the leaf area could be increased by 5.6%.

separation；Bacillusbrevis；wheat water experiment；maize pot experiment

Q 93－331

A

1000－1565（2011）03－0294－05

2010－03－21

河北省科技支撐項(xiàng)目（062071250－2）

張愛(ài)民（1967－），男，河北保定人，河北大學(xué)副研究員，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀博士，主要從事農(nóng)業(yè)微生物研究.E－mail：zhangam2008＠yahoo.com.cn

趙藏賞）