采用原子力顯微鏡研究刺參體壁酶促溶性膠原蛋白的溶液聚集狀態*

董秀萍，朱蓓薇，祁立波，鄭杰，張爽，姜丹

1(大連工業大學，食品學院，遼寧大連，116034) 2(江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮 江，212013)3(大連魁氏食品有限公司，遼寧大連，116101)

采用原子力顯微鏡研究刺參體壁酶促溶性膠原蛋白的溶液聚集狀態*

董秀萍1，2，朱蓓薇1，2，祁立波3，鄭杰2，張爽1，姜丹1

1(大連工業大學，食品學院，遼寧大連，116034) 2(江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮 江，212013)3(大連魁氏食品有限公司，遼寧大連，116101)

為 研究刺參熱加工過程中體壁膠原蛋白的物性變化規律，利用原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)考察樣品濃度、溶劑和熱處理條件對刺參體壁酶促溶性膠原蛋白(pepsin-soluble collagen，PSC)溶液聚集狀態的影響。結果表明:在乙酸緩沖液(pH 2.7)、PBS緩沖液(pH 7.2)和超純水中，海參體壁酶促溶性膠原蛋白均隨著濃度的增大而逐漸開始自組裝，并最終形成無規則的團狀結構或者片狀網絡結構。但是，溶劑不同，其開始自組裝所需要的膠原蛋白濃度也不同。隨著加熱溫度的升高或加熱時間的延長，刺參體壁酶促溶性膠原蛋白分子逐漸聚集成網絡結構，但加熱溫度超過100℃或時間超過2 h后，其交聯程度逐漸降低，網絡結構逐漸消失。

刺 參體壁，PSC，AFM，聚集狀態

刺參(Stichopus japonicus)屬棘皮動物門，是一種珍貴的海洋無脊椎動物［1］。體壁是刺參主要的食用部位，主要由上皮組織和真皮結締組織構成［2－3］。刺參體壁蛋白的高甘氨酸含量，以及羥脯氨酸和羥賴氨酸的存在，表明其以膠原蛋白為主體［4－5］。在熱加工過程中，刺參的組織結構和流變學性質等會隨著熱處理條件的變化而發生明顯變化，這主要是由于膠原蛋白發生熱變性或凝膠化所導致的［6］，或者說，是由其真皮結締組織細胞間所填充的膠原類物質發生改變所引起的［7－8］。因此，研究刺參體壁膠原蛋白對指導刺參的加工具有重要意義。

自1986年Binning［9］發明原子力顯微鏡以來，該設備已經廣泛用于生物領域的各個方面，具有清晰度高、分辨率高和制樣要求相對簡單等特點［10］。本文從刺參體壁中提取酶促溶性膠原蛋白，并采用原子力顯微鏡對其在不同條件下的溶液聚集狀態進行研究，可以從一定程度上反映加工過程中刺參膠原蛋白的變化規律，從而為進一步實現對刺參熱加工過程物性變化的有效控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活刺參，產地為大連海洋島;刺參體壁酶促溶性膠原蛋白，自制;胃蛋白酶，購于Sigma公司;其余試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器和設備

2KBTES-55型真空冷凍干燥機(美國，Virtis);Z323K型冷凍離心機(德國，HERMLE);UV-2100分光光度計(美國，UNICO);YC-1層析實驗冷柜(北京博醫康實驗儀器有限公司);EMS-4B磁力攪拌器(天津歐諾儀器有限公司);DimensionTM3100原子力顯微鏡(美國，TMC)。

1.3 試驗方法

1.3.1 刺參體壁PSC的制備

參照李翠翠等所述的方法［11］，采用胃蛋白酶從刺參體壁中提取得到較高純度的膠原蛋白。所得膠原蛋白的純度通過紫外吸收光譜和紅外吸收光譜進行鑒定。

1.3.2 不同條件下刺參體壁PSC溶液的聚集狀態

1.3.2.1 樣品濃度和溶劑對刺參體壁PSC溶液聚集狀態的影響

分別用0.2 mol/L乙酸緩沖液(pH值2.7)、超純水和0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.2)溶解刺參體壁PSC，配制質量濃度為4.0 mg/mL的儲備液。然后將儲備液用不同的溶劑進行稀釋，分別得到以下濃度的稀釋液:0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL 和2.0 mg/mL。采用AFM進行觀察，考察樣品濃度和溶劑對膠原蛋白溶液聚集狀態的影響。

1.3.2.2 加熱溫度對刺參體壁PSC溶液聚集狀態的影響

將刺參體壁PSC溶解于pH值2.7的乙酸緩沖液中，在濃度為0.01 mg/mL、加熱時間為0.5 h的條件下，考察不同加熱溫度對樣品膠原蛋白溶液聚集狀態的影響。以未經加熱的刺參體壁PSC溶液作為對照。

1.3.2.3 加熱時間對刺參體壁PSC溶液聚集狀態的影響

將刺參體壁PSC溶解于pH值2.7的乙酸緩沖液中，在濃度為0.01 mg/mL、加熱溫度為80℃的條件下，考察不同加熱時間對膠原蛋白溶液聚集狀態的影響。以未經加熱的刺參體壁PSC溶液作為對照。

1.3.3 AFM樣品制備及觀察

1.3.3.1 AFM樣品制備

準確移取5 μL樣品溶液，滴于新鮮剝離的云母片上，使其自然鋪展，室溫下在空氣中自然干燥30 min以形成膠原吸附層［12］。對于中性膠原溶液，為消除溶劑中鹽分的干擾，可采用蒸餾水小心沖洗吸附層3次后于空氣中自然干燥［13］。

1.3.3.2 AFM樣品觀察

將樣品置于AFM樣品臺上，室溫條件下采用Tapping模式進行觀察。AFM探針微懸臂長度為180 μm，針尖曲率半徑為10 nm，針尖為商用氮化硅針尖，力常數為2.8 N/m。所有圖像只經過自動平滑處理，以消除慢掃描方向上的低頻噪音。每個樣品隨機選取6個不同的區域，每個區域至少進行20次掃描，從而確保得到可重復的高質量的圖像。

2 結果與分析

2.1 乙酸緩沖液中刺參體壁PSC的溶液聚集狀態

當刺參體壁PSC溶解于pH值2.7的乙酸緩沖液中時，不同樣品濃度下的溶液聚集狀態如圖1所示。由圖1可以看出，在較低濃度(0.01 mg/mL)時，刺參體壁酶促溶性膠原蛋白主要以單體形式存在(圖1A)，此時，大部分膠原蛋白分子還未開始組裝，只是簡單的吸附在云母表面。這可能是由于在酸性環境中樣品濃度較低時，多肽鏈上由膠原蛋白分子內肽鍵的酰胺基和溶液中的H+形成的-NH2+-的相互排斥作用占明顯優勢。然而，隨著樣品濃度的增加，多肽鏈上的疏水作用會逐漸超過排斥作用［14］。當濃度增加到0.05 mg/mL時，膠原蛋白分子逐漸開始進行自組裝，形成分散比較均勻的聚集體，但是大多獨立存在，未形成廣泛交聯(圖1B)。當濃度進一步增加到0.1 mg/mL后，聚集體纖維之間的交聯程度明顯增加，逐漸產生橫向融合，聚集體直徑明顯增大，在云母表面組裝成如圖1(C)～圖1(E)中所示的網絡結構，并最終形成不規則的團狀聚集體(圖1F)。

圖1 乙酸緩沖液中刺參體壁PSC的溶液聚集狀態

2.2 PBS緩沖液中刺參體壁PSC的溶液聚集狀態

當刺參體壁PSC溶解于pH值7.2的PBS緩沖液中時，不同樣品濃度下的溶液聚集狀態如圖2所示。由圖2可以看出，當樣品濃度為0.01 mg/mL和0.05 mg/mL時，刺參體壁酶促溶性膠原蛋白分子的數量極少，在AFM圖像中基本觀察不到膠原蛋白分子在云母表面的吸附。濃度為0.1～0.5 mg/mL時，膠原蛋白分子開始進行自組裝，少數膠原蛋白分子發生聚集，形成不規則的片狀聚集體。當濃度進一步增加到1.0 mg/mL時，許多膠原蛋白分子逐漸聚集，呈球形均勻分布在云母表面。而當濃度達到2.0 mg/mL時，膠原蛋白之間逐漸發生融合，形成如圖2F所示的片狀結構。這與鐘朝輝等［15］對魚鱗膠原蛋白溶液聚集行為研究的結果不同，可能與膠原種類不同有關。

圖2 PBS緩沖液中刺參體壁PSC的溶液聚集狀態

2.3 超純水中刺參體壁PSC的溶液聚集狀態

當刺參體壁PSC溶解于超純水中時，樣品濃度對膠原溶液聚集狀態的影響如圖3所示。由圖3可以看出，在樣品濃度為0.01和0.05 mg/mL時，刺參體壁酶促溶性膠原蛋白分子分布不均勻，部分發生聚集現象。而當濃度為0.1 mg/mL時，膠原蛋白聚集體增多，但在云母表面分布十分均勻。濃度為0.5 mg/mL時，膠原蛋白分子聚集狀態加劇，交聯程度增加，大部分分子聚集成球形網絡結構均勻分布在云母表面。隨著濃度的進一步增加，膠原蛋白分子繼續聚集，逐漸形成更大的球形結構，并最終變成比較大的無規則堆積結構(圖3F)。

比較圖2和圖3可知，同樣接近于pH值7.0，刺參體壁PSC在不同溶劑中的溶液聚集狀態明顯不同。當刺參體壁PSC溶解于pH值7.2的PBS緩沖液中時，在低濃度范圍內(0.01～0.05 mg/mL)基本觀察不到膠原蛋白分子的自組裝現象，而在超純水中，即使濃度較低，膠原蛋白分子也很容易形成聚集體。此外，膠原蛋白的溶液聚集狀態與其溶解于pH 2.7的乙酸緩沖液中時也有明顯區別，這說明刺參體壁PSC的溶液聚集狀態與溶劑及其pH值緊密相關。

2.4 加熱溫度對刺參體壁PSC溶液聚集狀態的影響

將刺參體壁PSC溶解于pH值2.7的乙酸緩沖液中，在濃度為0.01 mg/mL、加熱時間為0.5 h的條件下，不同加熱溫度對樣品膠原溶液聚集狀態的影響如圖4所示。

由圖4可以看出，加熱溫度對刺參體壁PSC的溶液聚集狀態有顯著影響。未經加熱時，膠原蛋白分子主要以少數單體形式存在。當溫度達到40℃后，膠原蛋白分子發生輕微聚集，形成少量聚集體，但仍孤立存在(圖4B)，之后逐漸發生融合，自組裝成大量球狀聚集體，密布在云母表面。當加熱溫度超過80℃時，膠原蛋白之間的聚集程度反而下降，網絡結構逐漸消失，至120℃時，在云母表面基本觀察不到膠原蛋白分子的吸附。這與高溫條件下膠原受熱變性發生降解，從而導致其結構被破壞有關。

2.5 加熱時間對刺參體壁PSC溶液聚集狀態的影響

將刺參體壁PSC溶解于pH值2.7的乙酸緩沖液中，在濃度為0.01 mg/mL、加熱溫度為80℃的條件下，不同加熱時間對樣品膠原溶液聚集狀態的影響如圖5所示。

圖3 超純水中刺參體壁PSC的溶液聚集狀態

圖4 加熱溫度對刺參體壁PSC溶液聚集狀態的影響

由圖5可以看出，刺參體壁PSC的溶液聚集狀態隨加熱時間的延長而發生明顯的變化。未經加熱時，膠原蛋白分子主要以少數單體形式存在。加熱0.5 h時，膠原蛋白分子開始發生聚集，但在云母表面的分布并不均勻。隨著加熱時間的延長，膠原蛋白分子之間交聯的程度不斷增強，形成直徑較大的聚集體，繼續延長其加熱時間，2.0 h時，膠原蛋白分子間交聯程度降低，發生一定程度的降解，分散成數量更多的、分布相對比較均勻的聚集體。

圖5 加熱時間對刺參體壁PSC溶液聚集狀態的影響

3 結論

本文利用AFM考察了樣品濃度、溶劑、加熱溫度及時間對刺參體壁PSC的溶液聚集狀態的影響，得出以下結論:

(1)刺參體壁PSC分子有在固體表面自組裝的特性。其在溶液中的聚集狀態與樣品濃度、溶劑密切相關。在pH值2.7乙酸緩沖液、pH值7.2 PBS緩沖液和超純水中，隨著PSC濃度的增加，聚集程度均逐漸加劇，最終形成無規則的線團結構或片狀聚集體。但是溶劑不同，PSC分子進行自組裝的難易程度不同;

(2)熱處理條件達到一定溫度和時間后，使刺參體壁PSC的結構發生改變，從而影響其在溶液中的聚集狀態。

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Studies on the Aggregation of Pepsin-soluble Collagen from Sea Cucumber Body Wall by AFM

Dong Xiu-ping1，2，Zhu Bei-wei1，2，Qi Li-po3，Zheng Jie2，Zhang Shuang1，Jiang Dan1
1(Dalian Polytechnic University，School of Food Science and Technology，Dalian 116034，China)2(Jiangsu University，School of Food and Biological Engineering，Zhenjiang 212013，China)3(Dalian Kuishi Canned Food Co.，Ltd，Dalian 116101，China)

In order to study the changes of collagen from sea cucumber body wall during heating process，the AFM method was adopted to investigate the influence of sample concentration，solvents，heating processing temperature and heating time on the aggregation states of PSC from sea cucumber body wall.The results showed that in acetate buffer(pH 2.7)，PBS buffer(pH 7.2)and ultra-pure water solution，collagen self－assembled gradually as the concentration increased and net－work of random coils or schistose structure were formed eventually.But the concentration of PSC needed to start self-assemble was different in the solutions mentioned above.The collagen self-assembled gradually to net-work as the heating temperature rised or the heating time prolonged.But，when the temperature was higher than 100℃ or the time was longer than 2 h，its crosslinking degree would decrease and the net－work structure disappeared gradually.

sea cucumber body wall，PSC，AFM，aggregation state

博士研究生(朱蓓薇教授為通訊作者)。

*國家自然科學基金項目(30571449);科技部國際重大合作項目(2006DFA32580);遼寧省教育廳A類項目(2008068)

2010－10－18