以蔗糖為原料明串珠菌發酵生產甘露醇

金紅星，史建波，成文玉，莒曉艷

(河北工業大學化工學院，天津，300130)

以蔗糖為原料明串珠菌發酵生產甘露醇

金紅星，史建波，成文玉，莒曉艷

(河北工業大學化工學院，天津，300130)

腸 膜明串珠菌CGMCC 1.10327為發酵菌株，質量濃度為2%的蔗糖為底物，采用分批發酵，研究甘露醇的生成。為了優化甘露醇的生成，分別考察了添加5 g/L的葡萄糖、3種鹽(K2HPO4、乙酸鈉、檸檬酸銨)、不同的初始pH和加入0.2%的CaCO3對產甘露醇的影響。結果表明，葡萄糖的加入有助于提高甘露醇的產量。3種鹽(K2HPO4、乙酸鈉、檸檬酸銨)對甘露醇的生成有明顯的影響，當分別為2 g/L、5 g/L和2 g/L時，甘露醇的產量最高。最佳的初始pH=6。向培養基中加入0.2%的CaCO3，甘露醇的產量明顯的降低。

蔗 糖，腸膜明串珠菌，分批發酵，甘露醇

甘露醇是一種多元醇，白色結晶性粉末，甜度為蔗糖的一半。在醫藥、化工、食品等行業具有廣泛的應用［1－2］。目前生產甘露醇的方法主要是催化加氫，以鎳(Ni)為催化劑在高溫(120～160℃)高壓(70～140atm)下加氫還原葡萄糖/果糖(1∶1)的混合物，其中葡萄糖全部轉化為甘露醇的異構體山梨醇，果糖50%轉化為甘露醇，而另50%轉化為山梨醇，山梨醇和甘露醇之比為3∶1［3］。催化加氫法有很多缺點:需要高純度原料，包括氫氣，昂貴的金屬催化劑等;需要較高的溫度和壓力;需要昂貴的色譜純化方法從產品中除去鎳;甘露醇的產率低;山梨醇和甘露醇的分離純化比較困難［2］。

一些微生物可利用果糖或葡萄糖發酵產生甘露醇［4－8］。與化學合成法相比微生物發酵法有很多優點，比如沒有副產物山梨醇的產生、溫和的反應條件、不需要高純度原料、分離純化設備要求不高等［2］。近些年人們關注于異型發酵的乳桿菌、明串珠菌，能夠在胞內產生一種甘露醇脫氫酶，將果糖高效轉化為甘露醇，而不產生山梨醇［9］。但果糖作為底物相對比較昂貴，不利于工業化生產。為了降低生產成本，必需選擇廉價的底物［10］。蔗糖相對便宜，并且大量存在于自然界中，能夠被明串珠菌利用產生甘露醇。本研究以蔗糖為底物，優化明串珠菌發酵生成甘露醇。

1 材料和方法

1.1 實驗材料1.1.1 菌株

腸膜明串珠菌CGMCC 1.10327，本實驗室保藏。

1.1.2 培養基

MRS培養基:蔗糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO4·H2O 0.039 g/L，K2HPO42 g/L，檸檬酸銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.2，121℃滅菌 15 min。

1.1.3 主要儀器

722N型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 培養方法

發酵培養:按接種量1% 接種于裝有100 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶中，于30℃，120 r/min振蕩培養，不通空氣。發酵培養基的初始pH值調至6.0。

1.3 分析方法

菌體的生物量:將0.5 mL發酵液稀釋10倍，測定稀釋液在600 nm的濁度(OD600)。取5 mL發酵液，離心收集菌體并用蒸餾水洗滌2次后置于凍干機中冷凍干燥，干燥完全后在分析天平上測量細胞干重。建立濁度與細胞干重的標準曲線，利用標準曲線將濁度轉化為細胞干重，作為菌體的生物量。

甘露醇的量:將發酵液離心沉淀，取上清液，采用改進的高碘酸鈉氧化法檢測甘露醇的量［11］。每一樣品進行3次平行檢測，取平均值。

2 結果和討論

2.1 添加葡萄糖對產甘露醇的影響

將明串珠菌CGMCC 1.10327接種于含葡萄糖(葡萄糖5 g/L，其他成分與MRS相同)和不含葡萄糖(MRS)的2種發酵培養基中，進行分批發酵，研究葡萄糖對產甘露醇的影響，結果見圖1。從圖1中可以看出，葡萄糖的加入對菌體的生長速率和生長總量幾乎沒有影響。明串珠菌在蔗糖中的生長速率大于在葡萄糖的生長速率［12］。由此可見，葡萄糖和蔗糖同時存在時，對菌體的生長并沒有產生疊加效應。

圖1 葡萄糖對產甘露醇的影響

葡萄糖的加入有助于提高甘露醇的產量(見圖1)。在含有葡萄糖的發酵培養基中，甘露醇的最高產量為7.05 g/L，在不含葡萄糖的發酵培養基中，甘露醇的最高產量為5.6 g/L，葡萄糖的加入明顯的提高了甘露醇的產量。在發酵中，蔗糖代謝產生的果糖部分轉化為甘露醇，部分進行能量代謝。葡萄糖的加入有利于蔗糖代謝產生的果糖更多的轉化為甘露醇，從而提高了甘露醇的轉化率。

2.2 三種鹽對產甘露醇的影響

在培養基(酵母浸粉2 g/L，去掉蛋白胨，其它成分與MRS相同)中考察了3種鹽(K2HPO4、乙酸鈉、檸檬酸銨)對產甘露醇的影響。設計單因素實驗，每一種鹽選取5個不同的濃度，發酵18 h檢測甘露醇和菌體的量，結果見表1。從表1可以看到，K2HPO4、乙酸鈉和檸檬酸銨的加入對明串珠菌發酵產甘露醇有明顯的影響，當K2HPO4、乙酸鈉和檸檬酸銨的量分別為2 g/L、5.0 g/L和2 g/L，甘露醇的產量最高。

明串珠菌以蔗糖為底物進行發酵時，在胞內生成一種蔗糖磷酸酶，將蔗糖轉化為1-磷酸-D-葡萄糖(Glc-1-P)和D-果糖［13］，在這個反應中需要磷酸根離子作為底物，當培養基中不存在磷酸根離子時，蔗糖磷酸酶的催化反應受到抑制，因此甘露醇的轉化量減少。Yun［6］研究了在明串珠菌Y-002發酵果糖產生甘露醇的過程中不同的磷酸根離子濃度對發酵產生的影響，發現隨著磷酸根離子濃度的增加，甘露醇的產量有輕微的增加。明串珠菌在發酵蔗糖時生成乳酸和乙酸，當在培養基中加入適量的乙酸鈉，乙酸鈉在作為緩沖劑的同時，可能對乳酸和乙酸的代謝產生反饋抑制作用，進而有利于甘露醇的生成。在細胞中檸檬酸分解成乙酸和草酰乙酸，草酰乙酸脫羧變為丙酮酸，丙酮酸進一步代謝形成乳酸。檸檬酸代謝產生的能量(NAD(P)H)有利于果糖轉化為甘露醇［14］。

表1 三種鹽(K2HPO4、乙酸鈉、檸檬酸銨)對產甘露醇的影響

2.3 初始pH值對產甘露醇的影響

在培養基(酵母浸粉2 g/L，去掉蛋白胨，其他成分與MRS相同)中考察初始pH值對明串珠菌發酵產甘露醇的影響，將培養基的初始pH值分別調至5、5.5、6、6.5、7，結果見圖 2。

圖2 不同初始pH值發酵18 h甘露醇和菌體的量

從圖2中可以清晰看出，當初始pH值為7時，菌體的生長量最大(在本試驗的pH范圍內)，隨著初始pH的降低，菌體的生長量隨之減少。當初始pH值為6時，甘露醇的產量最大，達到7.45 g/L。結果表明，初始pH值過低時，抑制了菌體的生長代謝，從而對底物的利用率降低，因此甘露醇產量明顯減少。當初始pH值較高時，菌體的生長代謝相對旺盛，更多的底物進入戊糖磷酸代謝途徑轉化為乳酸和乙酸，其中由蔗糖代謝產生的果糖可能更多的進入能量代謝途徑，而沒有轉化為甘露醇，致使甘露醇的產量有所減少。因此我們選擇初始pH值為6作為發酵蔗糖產甘露醇的最優初始值。

2.4 添加CaCO3對產甘露醇的影響

在培養基(酵母浸粉2 g/L，去掉蛋白胨，其他成分與MRS相同)中加入質量濃度為0.2%的CaCO3，考察CaCO3對產甘露醇的影響，結果見圖3。從圖3中可見，CaCO3的加入有助于菌體的生長，菌體的生長速率和生長量相對于不加入CaCO3的發酵液有明顯提高。在含有CaCO3的發酵液中甘露醇的最大產量為4.12 g/L，而在不含有CaCO3的發酵液中甘露醇的最大產量為7.1 g/L。CaCO3的存在使甘露醇的產量明顯的減少。

圖3 添加CaCO3對產甘露醇的影響

明串珠菌在發酵蔗糖時，代謝產生乳酸和乙酸，發酵液的pH值會大幅度下降，最終達到4左右［6］。在培養基中加入CaCO3，中和乳酸和乙酸，調節發酵液的pH值，促使更多的果糖進入戊糖磷酸途徑代謝產生能量，進而促進細胞的生長，而降低甘露醇的轉化率，最終影響甘露醇的產量。因此，在相同的發酵條件下，調節發酵液的pH值并不能促進甘露醇的生成，反而降低甘露醇的產量。

3 結論

(1)以質量濃度為2%的蔗糖為底物進行明串珠菌發酵時，5 g/L葡萄糖的加入對菌體的生長不產生影響，但明顯的提高了甘露醇的產量。

(2)3種鹽(K2HPO4、乙酸鈉、檸檬酸銨)的單因素試驗表明，3種鹽的量分別為2、5.0和2 g/L時，甘露醇的產量最高。

(3)從不同初始pH值試驗可以看出，初始pH值6時，甘露醇的產量最大。

(4)CaCO3添加試驗可以看出，調節發酵液的pH不利于甘露醇的轉化，降低了甘露醇的產量。

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Production of Mannitol from Sucrose by Leuconostoc mesenteroides

Jin Hong-xing，Shi Jian-bo，Cheng Wen-yu，Ju Xia-yan
(Institute of Chemical Technology，Hebei University of Technology，Tianjing 300130，China)

The production of mannitol by Leuconostoc mesenteroides CGMCC 1.10327 using sucrose(2%，m/v)as the carbon source was investigated in batch culture fermentation.To optimize the production of mannitol，the effects of glucose(5 g/L)，three salt nutrients(K2HPO4，NaAC，and ammonium citrate)，various initial culture pHs，and 0.2%CaCO3on the production of mannitol were investigated，respectively.The results showed that glucose contributed to improve the yield of mannitol.Three salt nutrients(K2HPO4，NaAC，and ammonium citrate)had significant effects on the production of mannitol，and the highest yield of mannitol was obtained when three salt nutrients were 2 g/L，5.0 g/L，and 2 g/L，respectively.The highest yield of mannitol was obtained at initial pH 6.0.Moreover，the yield of mannitol was significantly decreased by adding CaCO3.

sucrose，Leuconostoc mesenteroides，in batch culture fermentation，mannitol

博士，副教授。

2010－09－05，改回日期:2010－10－30