海洋卡盾藻日本株過氧化氫產生的影響因素

江 濤,陳文靜,吳 霓,江天久,* (.暨南大學赤潮與水環境研究中心,廣東 廣州 5063；.華南師范大學生命科學學院,廣東 廣州 50630)

海洋卡盾藻日本株過氧化氫產生的影響因素

江 濤1,陳文靜2,吳 霓1,江天久1,2*(1.暨南大學赤潮與水環境研究中心,廣東 廣州 510632；2.華南師范大學生命科學學院,廣東 廣州 510630)

對海洋卡盾藻日本株(Chattonella marina Japan,CMJP)在不同鹽度、營養鹽條件及不同生長期的過氧化氫產生特點進行了研究.結果表明:H2O2濃度峰值出現在CMJP對數生長期(4～8d),以第6d達到最大,為0.97×10-4nmol/cell.在N:P為8:1和16:1的情況下,CMJP生長較快,藻細胞在對數生長末期之前一直保持較高密度.CMJP產生的H2O2量與藻類生長呈現出一定的相反趨勢,在藻細胞適宜生長的N:P下,產生的H2O2濃度較小.在N:P為16:1時單個藻細胞的H2O2量最低(0.40×10-4nmol/cell),僅是N:P為32:1時(1.17 ×10-4nmol/cell)的1/3,N:P為8:1時,單個藻細胞的H2O2濃度為0.63 ×10-4nmol/cell. CMJP在鹽度為20,25psu時生長較好且藻細胞達到較高密度,在鹽度為10,15,30psu時藻密度較低,表明低鹽和高鹽條件均不利于CMJP的生長.鹽度對 CMJP過氧化氫的產量有一定的影響,在高鹽度下單個藻細胞的H2O2產量增加,鹽度為30psu時,H202濃度最高(1.1×10-4nmol/cell).

海洋卡盾藻；過氧化氫；活性氧

海洋卡盾藻(Chattonella marina)屬于針胞藻門(Rhaphidophyceae),卡盾藻屬(Chattonella),為單細胞藻類.自1964年在日本瀨戶內海首次出現后, 海洋卡盾藻赤潮時有發生,是日本海域的主要有害赤潮藻.我國首次記載的海洋卡盾藻赤潮發生于1991年3月大鵬灣鹽田海域[1],隨后該藻赤潮在廣東沿海頻繁爆發.目前海洋卡盾藻已成為我國南方重要的有害赤潮原因種,該藻赤潮發生頻率逐漸增加,范圍不斷擴大,危害日益嚴重,已經成為近海漁業生產的巨大威脅.

針胞藻門赤潮藻均能產生ROS,其中卡盾藻屬ROS產生效率最高[2],而ROS被證實是導致魚類死亡的關鍵因素之一[3-5].Twiner等[6]指出,赤潮異灣藻產生的ROS能夠改變魚鰓的結構和功能,導致魚類窒息而亡.另外,ROS也會影響魚類的酶活性,如鯡魚接觸到海洋卡盾藻后次級腮小葉的碳水化酶的活性顯著降低[7].Oda等[8]研究表明,海洋卡盾藻向水體中釋放 H2O2的量和藻細胞內H2O2濃度及生長階段均存在一定的關系,以對數生長期H2O2產量最大[8-9],但有關影響海洋卡盾藻 H2O2產生的因素研究尚不夠深入.為進一步探索海洋卡盾藻對魚的毒性機制,本文對海洋卡盾藻(日本株)在不同生長階段,鹽度,營養條件下過氧化氫的產生特點進行了研究,以期為海洋卡盾藻赤潮災害的預防和控制提供參考.

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

實驗所需儀器主要包括:熒光分光光度計(USA).

實驗所需試劑主要包括:30%過氧化氫溶液(生化試劑,International lab,USA),對羥基苯甲酸(Alfa, USA),辣根過氧化物酶(Sigma, USA),過氧化氫酶(2-5000U/mg,Sigma, USA),95%4-甲氧基苯甲醛(上海試劑一廠),其他試劑均為國產分析純.

1.2 藻種培養

海洋卡盾藻日本株(Chattonella marina Japan strain, CMJP)由香港城市大學Doris Au教授惠贈.自然海水經0.45μm微孔濾膜過濾,在120℃下高溫滅菌20min,冷卻到室溫.CMJP以f/2培養液進行培養.取對數生長末期的CMJP,以1:4的比例接種于三角瓶中,置于人工氣候箱中,培養溫度25℃,光照強度為3000lx,光暗循環L:D＝12h:12h.以下實驗除注明外,培養條件與此相同.

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑配制 辣根過氧化物酶溶液(1000U/mL):取辣根過氧化物酶5.0mg,溶于1mL超純水中,4℃避光保存.

過氧化氫酶溶液:取過氧化氫酶 10.0mg,溶于1mL超純水中,4℃避光保存.

對羥基苯甲酸(PHPA)溶液(1.5mmol/L):稱取對羥基苯甲酸0.023g溶解至100mL,4℃避光保存.

過氧化氫溶液(0.1mol/L):取 30%過氧化氫溶液1.0mL,稀釋至10.0mL,避光保存.

1.3.2 海洋卡盾藻日本株過氧化氫檢測的有效性 過氧化氫測定方法采用對羥基苯甲酸法[10].在辣根過氧化物酶和過氧化氫酶的催化下,過氧化氫將 PHPA氧化成熒光二聚體(PHPA)2.在激發波長(Ex)為 320nm下,對發射波長(Em)范圍400～600nm內進行掃描,確定最大發射波長.

為了驗證CMJP是否產生過氧化氫和PHPA方法對其檢測的有效性,首先對處于對數生長期的CMJP進行過氧化氫的測定.取1mL藻細胞培養液于10mL試管中,依次加入2mL 1.5mmol/L的PHPA溶液,30μL辣根過氧化物酶溶液,在過氧化氫酶存在或缺少時分別測定30s內熒光光譜.

1.3.3 過氧化氫標準曲線的測定 向 6支試管中分別按序加入 1.0mL不同梯度的過氧化氫溶液,2.0mL 1.5mmol/L的PHPA溶液,30μL辣根過氧化物酶溶液,使過氧化氫的最終濃度分別為3.3,6.6,13.2,19.8,26.4,33.0μmol/L.在過氧化氫酶存在或缺少的時候分別測定 30s內熒光強度,取兩者的差值為熒光強度.

1.3.4 不同生長時期的過氧化氫產生曲線 將處于對數生長期的CMJP重新接種后,每2d取藻液用0.1mL浮游植物計數框進行鏡檢計數.藻液取樣后進行過氧化氫的測定,并繪制過氧化氫的產生曲線.

1.3.5 鹽度和不同營養條件的影響 (1)設置 5種不同的氮磷比(4:1,8:1,16:1,32:1,64:1),按照以上5種氮磷比配制相應的培養基;(2)用超純水將自然海水稀釋成10,15,20,25,30psu等5個鹽度梯度.每組實驗設置 3個平行(保證起始密度大于1.0×103cells/mL).每 2d對藻細胞進行計數(第2,4,6,8,10,12d),第4,6,8d對藻細胞培養液取樣進行過氧化氫產量測定.

2 結果與分析

2.1 PHPA法對海洋卡盾藻日本株過氧化氫檢測的有效性

在激發波長為320nm下,對(PHPA)2的熒光二聚體發射波長掃描,結果表明過氧化氫對對PHPA氧化產物的最大發射波長為 405nm.本實驗采用405nm為檢測發射波長.CMJP培養液在未添加過氧化氫酶時,熒光發射光譜最大強度為1.91a.u.,添加過氧化氫酶后最大強度為14.74a.u.(圖1),說明CMJP能夠產生過氧化氫.根據Hyslop等的方法[6],測得過氧化氫的熒光標準曲線為y=0.3711x-0.7301 (R2=0.9759),其中y為熒光強度(a.u.),x為過氧化氫濃度.

圖1 CMJP培養液在缺少過氧化氫酶和添加過氧化氫酶后的熒光強度曲線Fig.1 Florescence spetrum of CMJP with the catalase absence and presence

2.2 海洋卡盾藻日本株不同生長時期過氧化氫的測定

圖2 海洋卡盾藻日本株的生長曲線Fig.2 Growth curve of CMJP

CMJP在接種后4d進入對數生長期,第10d藻細胞達到最大值(圖2).過氧化氫濃度峰值出現在CMJP對數生長期(4～8d),以第6d達到最大(圖3).CMJP在整個生長周期中產生的過氧化氫最高含量約為 0.97×10-4nmol/cell.為了減小隨機誤差,在隨后的實驗中,均采用第4,6,8d過氧化氫濃度的平均值進行比較.

圖3 海洋卡盾藻日本株過氧化氫的產生曲線Fig.3 Concentration-time profiles of peroxide hydrogen production

2.3 氮磷比對海洋卡盾藻日本株生長以及過氧化氫產生的影響

圖4 不同氮磷比條件下海洋卡盾藻日本株的生長曲線Fig.4 Growth of CMJP under different N:P ratios

CMJP在不同N:P培養條件下8d進入指數生長末期.在4～8d,CMJP在N:P為8:1和16:1時藻細胞密度較高,其中以N:P為8:1時最高,表明該藻在此N:P條件下適宜于生長(圖4).但CMJP產生H2O2的量與藻類生長呈現出一定的相反趨勢,在藻細胞適宜生長的N:P條件下,H2O2濃度較小.在N:P為8:1時,單位體積培養液中H2O2濃度最小(0.68μmol/L),N:P為 16:1時,H2O2濃度為0.96μmol/L,而N:P為4:1時,單位體積培養液中H2O2濃度達到 1.84μmol/L.對單個藻細胞 H2O2含量來講,在 N:P為 16:1時的 H2O2量最低(0.40×10-4nmol/cell),N:P為32:1時單個藻細胞的H2O2量最高(1.17 ×10-4nmol/cell) (圖5).

圖5 不同氮磷比條件下海洋卡盾藻日本株的過氧化氫產量Fig.5 Hydrogen peroxide concentration of CMJP under different N:P ratios

2.4 鹽度對海洋卡盾藻日本株生長以及過氧化氫產生的影響

圖6 不同鹽度條件下海洋卡盾藻日本株的生長曲線Fig.6 Growth of CMJP under different salinity

CMJP在鹽度為20,25psu時生長較好且藻細胞達到較高密度,在鹽度為10,15,30psu時藻密度較低,表明CMJP最適生長鹽度為20～25psu,低鹽和高鹽條件均不利于CMJP的生長(圖6).鹽度對CMJP過氧化氫的產量有一定的影響:在鹽度為30psu時,單位體積藻液和單個藻細胞的H2O2量最高,分別達到1.3μmol/L和1.1×10-4nmol/cell;鹽度在10～25psu范圍內,單位體積藻液及單個藻細胞的H2O2量差異不明顯(圖7).

圖7 不同鹽度條件下海洋卡盾藻日本株的過氧化氫濃度Fig.7 Hydrogen peroxide concentration of CMJP under different salinity

3 討論

本研究結果顯示,海洋卡盾藻日本株能夠產生微量H2O2.CMJP過氧化氫產量的峰值出現在對數生長期,隨后迅速降低(圖3).Oda等[8]研究表明,海洋卡盾藻向水體中釋放 H2O2的量和藻細胞內 H2O2濃度及生長階段均存在一定的關系,以對數生長期H2O2產量最大[8-9].微量活性氧在藻類某些生理現象的調控中發揮著重要的作用,特別是在細胞內信號轉導方面[9],CMJP對數生長期H2O2的大量產生可能與藻細胞本身的新陳代謝或者酶代謝有關[11].過氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶均能夠顯著抑制海洋卡盾藻的生長,從而推測H2O2和O2-是海洋卡盾藻生長過程中必需存在的產物[8].研究表明,低濃度的活性氧能夠顯著地促進三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、杜氏藻(Dunaliella sp.)和青島大扁藻(Platymonas helgolandica)等藻類的生長[12],從而進一步驗證了活性氧是某些微藻生長過程中必需的物質;但在高濃度活性氧的作用下,微藻的生長又受到明顯的抑制,說明高濃度的活性氧對微藻生長產生完全相反的生物學效應[12].

CMJP適宜生長的N:P值為8:1～16:1,但在此N:P值情況下,單位體積培養液或單個藻細胞H2O2量較低;CMJP在其他N:P值時生長受到抑制,但H2O2產量卻較高(圖4,圖5).環境條件能夠影響浮游植物細胞的化學組成,營養鹽限制一般會導致細胞內營養的減少[13].氮、磷限制可能會影響正常的細胞功能,如氮缺乏能降低植物的光合作用和呼吸作用,并且能增加氮還原酶、NADPH-谷氨酰胺脫氫酶和谷氨酰胺合成酶的活性[14].在氮、磷限制條件下,藻細胞酶活性的變化可能是導致 CMJP過氧化氫產量增加的原因.Liu等[9]認為,水體中N:P對海洋卡盾藻H2O2產率沒有影響,與本研究的實驗結果存在差異.本實驗是直接測量不同條件下藻液中 H2O2濃度,而Liu等[9]采用藻細胞濃縮再懸浮后30min測定H2O2的產率.兩者采用不同的測量方法可能是導致結論不一致的主要原因.

鹽度能通過參與滲透調節而控制細胞生長,是影響海洋卡盾藻細胞形態的重要物理因子[15].微藻對鹽度有一定的耐受范圍,較低和較高的鹽度均不利于海洋微藻生長.先前研究表明,海洋卡盾藻澳大利亞株對鹽度的耐受范圍為 15～50psu[15],而日本株最適宜生長的鹽度為25psu,耐受范圍為 10～35psu[16],與本研究結果相似.有關鹽度影響海洋卡盾藻過氧化氫產量的研究較少.本研究結果表明,鹽度在 10～25psu范圍內,單位體積藻液及單個藻細胞的 H2O2量變化不明顯,而高鹽度(30psu)則刺激H2O2產生.

海洋卡盾藻是典型的魚毒性赤潮原因種,其導致魚類死亡的機制還存在爭議.本課題組研究表明,海洋卡盾藻能夠產生溶血毒素,其粗提液對兔血紅細胞膜具有明顯的破壞作用,經薄層色譜檢測得出至少含有4 種組分,其中1 種可能為脂類,3 種為糖脂類[17].本文則進一步證實該藻能夠產生 H2O2.另外,卡盾藻屬赤潮藻還可能產生神經毒素,游離脂肪酸等有害物質[5,18].該藻赤潮爆發時,這些有毒物質是否共同存在?是哪種物

質的毒性起到主體作用?這些有毒物質對魚類的毒性是否存在協同作用?為什么相同種類的赤潮在不同地點爆發時毒性差異巨大,環境因素起到多大的控制作用? 這一系列問題都需要對魚毒性赤潮的毒性機理進行深入研究.

4 結論

4.1 H2O2濃度峰值出現在 CMJP對數生長期(4～8d),以第6d達到最大.

4.2 CMJP產生的H2O2量與藻類生長呈現出一定的相反趨勢,在藻細胞適宜生長的N:P下,產生的H2O2濃度較小.在N:P為16:1時單個藻細胞的H2O2量最低.

4.3 鹽度對CMJP過氧化氫的產量有一定的影響,在高鹽度下單個藻細胞的 H2O2產量增加,鹽度為30psu時,H2O2濃度最高.

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Study on production of peroxide hydrogen by Chattonella marina Japan strain.

JIANG Tao1, CHEN Wen-jing2, WU Ni1, JIANG Tian-jiu1,2*(1.Research Center of Harmful Algae and Aquatic Environment, Jinan Unversity, Guangzhou 510632, China；2.College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510630, China). China Environmental Science, 2011,31(11)：1864～1869

The induced peroxide hydrogen (H2O2) under different stages of C. marina which was treated at different salinity and nutrient conditions was studied. The results showed that high concentration of H2O2was observed during the logarithmic phase from 4 to 8 d, with the maximum value of 0.97×10-4nmol/cell on the 6th day. Under the N:P ratio of 8:1 and 16:1, CMJP possessed the relative higher growth rate and cell concentration. However, H2O2concentration was relatively low at those optimal N:P ratios, indicating the production of H2O2is negative to the growth of C. marina. The lowest concentration of peroxide hydrogen of CMHK was 0.40×10-4nmol/cell with the N:P ratio of 16:1, which was only one third of that with the N:P ratio of 32:1 (1.17 ×10-4). The concentration of peroxide hydrogen per cell was 0.63 ×10-4nmol/cell when N:P ratio was 8:1. The optimal salinities for the growth of CMJP were 20 and 25psu, where cell concentrations were relatively higher. However, cell concentrations were lower at the salinity of 10, 15 and 30psu, showing the growth of CMJP was depressed at relatively low and high salinity. Salinity also influenced the production of peroxide hydrogen. The concentration of peroxide hydrogen per cell was 1.1 ×10-4nmol/cell, the highest value among the experiments, at the salinity of 30 psu.

Chattonella marina；peroxide hydrogen；reactive oxygen species

X171

A

1000-6923(2011)11-1864-06

2011-02-17

國家自然科學基金資助項目(U0733006,41106090);國家“973”項目(2010CB428702);中央高校基本科研業務費專項資金(21610103,11610425);廣東省自然科學基金資助項目(S2011040003113)

* 責任作者, 研究員, tjiangtj@jnu.edu.cn

江 濤(1978-),男,山東安丘人,博士,助理研究員,主要研究方向為海洋環境化學.發表論文10篇.