香魚(yú)凝血因子X(jué)基因表達(dá)與鰻利斯頓氏菌感染的相關(guān)性

黃左安, 陳 炯, 陸新江, 史雨紅, 李明云

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)室, 浙江 寧波 315211)

香魚(yú)凝血因子X(jué)基因表達(dá)與鰻利斯頓氏菌感染的相關(guān)性

黃左安, 陳 炯*, 陸新江, 史雨紅, 李明云

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)室, 浙江 寧波 315211)

凝血途徑的關(guān)鍵因子——凝血因子X(jué) (coagulation factor X, FX), 是一種與免疫調(diào)控密切相關(guān)的維生素K依賴型絲氨酸蛋白酶。該研究克隆了香魚(yú) (Plecoglossus altivelis) FX基因全長(zhǎng)cDNA序列, 它由1 817個(gè)核苷酸組成, 包含一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框, 編碼一個(gè)由453個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量為5.07 × 104的蛋白。香魚(yú)FX與已知的哺乳動(dòng)物FX的結(jié)構(gòu)相似, N端24個(gè)殘基為信號(hào)肽序列。序列比較表明, 香魚(yú)FX與斑馬魚(yú)FX的氨基酸同一性最高, 為53%。在健康香魚(yú)中, FX基因mRNA主要在肝組織中表達(dá), 腦和鰓中也有少量表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析揭示, 鰻利斯頓氏菌感染后香魚(yú)肝組織中FX基因mRNA表達(dá)顯著上調(diào), 16 h時(shí)達(dá)到5.43倍。通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了香魚(yú)FX絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域, 并制備了抗血清。Western blotting分析顯示, 鰻利斯頓氏菌感染后香魚(yú)血清中FX含量顯著增加, 并隨著時(shí)間延長(zhǎng)上調(diào)倍數(shù)不斷增大, 在36 h時(shí)達(dá)到3.68倍。據(jù)此, FX基因mRNA及蛋白的表達(dá)與鰻利斯頓氏菌感染香魚(yú)的過(guò)程緊密相關(guān), 揭示它可能在魚(yú)類抗細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)中起重要作用。

凝血因子X(jué); 香魚(yú); 鰻利斯頓氏菌; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR; Western blotting

凝血因子X(jué) (coagulation factor X, FX) 是動(dòng)物內(nèi)源性和外源性凝血途徑共同通路的關(guān)鍵酶(Krupiczojc et al, 2008)。在機(jī)體受傷出血時(shí), FX被激活轉(zhuǎn)變?yōu)镕Xa, 能與FVa、Ca2+、磷脂共同作用將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶, 從而發(fā)揮凝血效應(yīng)(Borensztajn et al, 2008)。此外, FX在免疫方面發(fā)揮著非常重要的作用。FXa能激活蛋白酶激活受體-1 (PAR-1)和蛋白酶激活受體-2 (PAR-2), 參與免疫調(diào)控維持機(jī)體免受病原體侵害 (Schoenmakers et al, 2005; Borensztajn & Spek, 2011); FXa能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞白介素-6 (IL-6) 和促炎細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF) 的表達(dá), 與炎癥反應(yīng)相關(guān)(Cirino et al, 1997; Papapetropoulos et al, 1998; Shimizu et al, 2004); FX參與補(bǔ)體系統(tǒng)功能中心C3的激活, 從而參與補(bǔ)體系統(tǒng)涉及的免疫過(guò)程(Amara et al, 2008)。近年來(lái), 哺乳類、鳥(niǎo)類、爬行類、魚(yú)類等多個(gè)物種的 FX基因序列已被測(cè)定(Pendurthi et al, 1997; Heidtmann & Kontermann, 1998; St Pierre et al, 2005; Kimura et al, 2009; Jima et al, 2009; Leong et al, 2010)。

香魚(yú) (Plecoglossus altivelis) 隸屬胡瓜魚(yú)目香魚(yú)科, 是東亞地區(qū)中國(guó)、日本和朝鮮等國(guó)家特有的一種小型經(jīng)濟(jì)名貴魚(yú)類。高密度人工養(yǎng)殖導(dǎo)致病害頻繁發(fā)生, 其中鰻利斯頓氏菌 (Listonella anguillarum) 是養(yǎng)殖香魚(yú)的主要病原菌之一, 造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失 (Li et al, 2009)。人工養(yǎng)殖香魚(yú)以無(wú)污染和綠色健康為特色, 抗生素和農(nóng)藥防治病害受到諸多限制。因此, 迫切需要深入研究香魚(yú)免疫相關(guān)基因來(lái)指導(dǎo)香魚(yú)病害防治 (Uenobe et al, 2007; Chen et al, 2008)。由于FX基因在動(dòng)物免疫反應(yīng)中起重要作用, 我們擬對(duì)其進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增 (RACE)的方法成功獲得香魚(yú)FX基因的cDNA 全序列, 明確了它的序列特征、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和 mRNA 的組織表達(dá)特征, 并原核表達(dá)制備了抗血清, 隨后分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR) 和Western blotting研究了鰻利斯頓氏菌侵染后香魚(yú)肝組織 FX基因mRNA和血清FX蛋白的表達(dá)變化, 為進(jìn)一步深入研究FX 在魚(yú)類抗細(xì)菌免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

健康香魚(yú)個(gè)體體重 20～25g, 購(gòu)自寧波水產(chǎn)大世界。大腸桿菌TG1菌株和載體pBluescript SKII (+)由本實(shí)驗(yàn)室保存。RNAiso試劑、Oligotex-d T30＜super＞ mRNA Purification Kit、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Ex TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、cDNA Library Construction Kit和SYBRPremixEx Taq試劑盒均購(gòu)自 Takara公司; Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)mega公司; 引物合成及序列測(cè)定由上海英駿生物工程公司完成; 二抗 (辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG)購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司; ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、顯影定影試劑盒、柯達(dá)X-OMAT BT膠片和壓片暗盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。ICR小鼠購(gòu)自寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鰻利斯頓氏菌香魚(yú)分離株ayu-H080701由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 香魚(yú)FX基因cDNA序列的獲得

提取健康香魚(yú)肝臟總 RNA, 經(jīng) 1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性, 紫外分光光度計(jì)進(jìn)行純度分析。用Oligotex-dT30純化mRNA, 以其為模板, 采用cDNA Library Construction Kit構(gòu)建香魚(yú)肝cDNA文庫(kù), 具體方法參照廠家說(shuō)明。隨機(jī)挑取287個(gè)插入片段≥800 bp 的克隆進(jìn)行序列測(cè)定。將獲得的cDNA序列通過(guò) BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/)與 GenBank中的序列進(jìn)行比較分析,篩選與已知物種 FX基因相似的部分序列, 并用RACE技術(shù)獲得香魚(yú)FX全長(zhǎng)cDNA序列。

1.3 序列分析

信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)采用 SignalP 3.0系統(tǒng) (http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 多重序列比對(duì)采用ClustalW程序 (http://clustalw.ddbj.nig. ac.jp/), 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用MEGA 4.0 (Tamura et al, 2007)。

1.4 香魚(yú)FX基因mRNA的組織表達(dá)特征分析

采用RNAiso試劑提取香魚(yú)各組織總RNA, 并用DNase I (RNase-free) 進(jìn)行處理。取1 μg總RNA為模板, oligo (dT)30為引物, 用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶在42 ℃作用1.5 h, 合成第一鏈cDNA。根據(jù)已獲得的香魚(yú) FX基因 cDNA序列設(shè)計(jì)引物, FXtest (+): 5′-CCACCCACTTCAAAGTATGCC-3′和FXtest (-):5′-TGACATGGGTGAGAGCAGCA-3′, 預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為386 bp; 根據(jù)香魚(yú)看家基因β-actin cDNA序列(AB020884) 設(shè)計(jì)引物, pActin2 (+): 5′-TCGTGCGT GACATCAAGGAG-3′和pActin2 (-): 5′-CGCACTTC ATGATGCTGTTG-3′, 預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為231 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL, 包括cDNA 模板0.5 μL, 10× Ex PCR 緩沖液2.5 μL, dNTP混合物 (各2.5 mmol/L) 2 μL, 正向和反向引物 (10 μmol/L) 各1 μL, Ex Taq DNA 聚合酶(5U/μL) 0.25 μL 和滅菌水17.75 μL。PCR 反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性；2 min 后按下列程序進(jìn)行30個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s, 58 ℃ 退火30 s, 72 ℃延伸30 s；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 鰻利斯頓氏菌侵染的香魚(yú)肝 FX基因 mRNA表達(dá)變化

取鰻利斯頓氏菌感染后不同時(shí)間香魚(yú)肝組織,檢測(cè)FX基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。參照RNAiso操作說(shuō)明書(shū), 對(duì)每組的5條香魚(yú)肝組織總RNA進(jìn)行提取, 并將同一組的 RNA進(jìn)行等量混合。第一鏈cDNA合成, RT-qPCR的引物序列同1.4。25 μL PCR的反應(yīng)體系包括SYBRPremix Ex Taq(2×) 緩沖液12.5 μL、引物各1 μL、模板0.5 μL、滅菌水10 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀上進(jìn)行, 程序?yàn)?4 ℃ 180 s (1個(gè)循環(huán)), 隨后進(jìn)入擴(kuò)增階段, 共40個(gè)循環(huán), 每一循環(huán)包括: 94 ℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72 ℃ 30 s。為確保特異性擴(kuò)增, PCR結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析, 條件是94 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 95 ℃ 30 s (1個(gè)循環(huán))。為保證PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性, 每一個(gè)樣品重復(fù)分析 3次, 包括目標(biāo)基因 (FX)和看家基因 (β-actin)。熒光定量的結(jié)果采用儀器自帶程序 MxPro 3.2讀取。根據(jù) Livak & Schmittgen (2001)提出的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-ΔΔCt對(duì)相對(duì)定量的結(jié)果進(jìn)行分析, 獲得香魚(yú)肝組織 FX基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 香魚(yú)FX的原核表達(dá)和抗血清制備

由于香魚(yú)FX全長(zhǎng)基因在pET28a、pET22b、pET15b、pSBET等載體中均不表達(dá)。因此, 我們選擇性表達(dá)香魚(yú)FX絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。設(shè)計(jì)引物對(duì) pET-FX (+): 5′-CCATATGATCCAAATCCATAAG ATCTATAT-3′和pET-FX (-): 5′-GGGATCCTCAAGG TTGGGGATAAACAGCA-3′ (下劃線為添加的限制性內(nèi)切酶NdeI和BamH I的識(shí)別序列), 以cDNA為模板PCR擴(kuò)增獲得目的片段, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離后, 用QIAquick Gel Extraction純化。純化產(chǎn)物用NdeI和BamH I雙酶切后, 插入到同樣雙酶切的原核表達(dá)載體 pSBET中, 獲得重組質(zhì)粒pSBET-FX。pSBET-FX轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 pLys E菌株, IPTG 誘導(dǎo)表達(dá), 細(xì)菌裂解產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離, 考馬斯亮藍(lán)G-250染色檢測(cè)表達(dá)情況。

重組菌體大量誘導(dǎo)后, 經(jīng) 12% SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE兩次分離, 用0.25 mol/L KCl染色后, 切下目的條帶用以免疫小鼠。共免疫3次, 每次間隔一周。于第3次免疫后的第3天眼動(dòng)脈取血, 4 ℃靜置4 h以上, 冷凍離心后取上清, 分裝后保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western blotting檢測(cè)

香魚(yú)尾靜脈抽取血漿后于4 ℃靜置4 h, 冷凍離心取上清, 將上清樣品用 Bradford法定量(Bradford, 1976)。0 h對(duì)照、4、8、12、16、24和36 h的血清蛋白樣品經(jīng)5%濃縮膠 (100 V, 1 h) 和12%分離膠 (130 V, 2 h) 電泳, 將凝膠放置于等面積的已潤(rùn)濕的 NC膜上, 然后夾在濾紙中, 濾紙上下各三層, 濕轉(zhuǎn)法35 V轉(zhuǎn)移3 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后, 用10%脫脂奶粉的 PBS-T 37 ℃封閉 2 h。隨后一抗4 ℃孵育過(guò)夜, 一抗用 5%BSA和 0.02%疊氮鈉的PBS-T稀釋。一抗結(jié)束后, 將NC膜用PBS-T 15 min洗一次, 5 min三次。然后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (用PBS-T 1∶5 000稀釋), 37 ℃溫浴1 h。再用PBS-T 15 min洗一次, 5 min四次, 加上ECL于暗室顯影。條帶用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 香魚(yú)FX基因cDNA序列分析

287 個(gè)隨機(jī)挑選的克隆中共篩選到 8個(gè)陽(yáng)性克隆, 經(jīng)測(cè)序分析, 與已知其他動(dòng)物 FX基因具有較高的同源性, 且這些序列彼此間同源性＞99%。隨即用RACE方法獲得了香魚(yú)FX基因全長(zhǎng)cDNA序列 (EMBL登錄號(hào): FR851398)。 它由1 817個(gè)核苷酸組成, 3′-末端具有poly(A) 尾, 含一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框, 起始于第234～236 位的ATG起始密碼子, 終止于第1 593～1 595位的TGA終止密碼子, 推測(cè)編碼一個(gè)由 453個(gè)氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量為 5.07 × 104的蛋白。分析表明,序列的3′-端非編碼區(qū)長(zhǎng)222個(gè)核苷酸, 多腺苷酸化信號(hào)序列“AATAAA”位于第1 801～1 806位 (圖1)。香魚(yú)FX的N端24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列, 其氨基酸序列還包括γ-羧基谷氨酸結(jié)構(gòu)域 (Ala 43～Val 88)、兩個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域 (Asp 89～Glu 125、Ser 129～Cys 167) 和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域 (Glu 190～Lys 437) 三種保守的結(jié)構(gòu)域, 其中γ-羧基谷氨酸結(jié)構(gòu)域中包含10個(gè)保守的γ-羧基谷氨酸。

全長(zhǎng)氨基酸序列比較表明, 香魚(yú) FX與斑馬魚(yú)FX同一性最高, 為53%, 與大西洋鮭FX的同一性為48%, 而與哺乳動(dòng)物FX的同一性為44%～46%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明, 魚(yú)類、哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類和爬行類FX分別成簇 (圖2)。

圖1 香魚(yú)FX基因cDNA核苷酸序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequences of ayu FX cDNA and deduced amino acid sequences

圖2 基于NJ法構(gòu)建香魚(yú)和其它動(dòng)物全長(zhǎng)FX蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 FX phylogenetic tree of ayu and other animals based on NJ method

2.2 香魚(yú)FX基因mRNA的組織表達(dá)特征

取健康香魚(yú)肝、脾、腎、腦、心、鰓、肌肉和腸進(jìn)行RT-PCR檢測(cè), FX擴(kuò)增產(chǎn)物為386 bp, 內(nèi)參β-actin為231 bp。RT-PCR結(jié)果表明, 健康香魚(yú)FX基因mRNA主要在肝中表達(dá), 在腦和鰓中也有微量表達(dá) (圖3)。

2.3 鰻利斯頓氏菌侵染前后香魚(yú) FX基因 mRNA的表達(dá)變化

鰻利斯頓氏菌感染的香魚(yú)呈現(xiàn)出肌肉腐爛, 腸道、鰓蓋和魚(yú)鰭基部充血發(fā)紅等典型的細(xì)菌敗血癥癥狀, 而對(duì)照香魚(yú) (注射生理鹽水) 未表現(xiàn)出任何異常現(xiàn)象。由于香魚(yú)FX基因mRNA主要在肝中表達(dá)。因此, 我們選取鰻利斯頓氏菌感染香魚(yú)4、8、12、16、24和36 h的肝組織, 進(jìn)行RT-qPCR分析。結(jié)果表明, 與對(duì)照組相比, 4 h時(shí), 染病香魚(yú)FX基因mRNA的表達(dá)量無(wú)明顯變化; 8 h后, 表達(dá)量顯著增加 (P＜0.05); 16 h時(shí), 表達(dá)量達(dá)到峰值 (P＜0.05),約為對(duì)照組的5.43倍(圖4)（ANOVA,t-test）。

圖3 香魚(yú)FX基因mRNA的組織表達(dá)特征Fig.3 The mRNA expression patterns of ayu FX

圖4 利斯頓氏菌感染前后香魚(yú)肝組織中FX基因mRNA的表達(dá)變化Fig. 4 Analysis of liver FX mRNA expression changes post L anguillarum infection in ayu.

2.4 香魚(yú)FX基因絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)

原核表達(dá)質(zhì)粒 pSBET-FX經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后,在大腸桿菌 BL21 pLys E中經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá), SDS-PAGE分離菌體蛋白, 出現(xiàn)一條高表達(dá)的誘導(dǎo)蛋白帶, 相對(duì)分子質(zhì)量為2.3×104左右 (圖5 a), 與預(yù)測(cè)的香魚(yú) FX絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域相對(duì)分子質(zhì)量大小 (2.26×104) 相符。該片段切膠純化后免疫小鼠,制備抗血清。

圖 5 香魚(yú) FX絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)和 Western blotting分析Fig. 5 Prokaryotic expression and Western blotting analysis of serine proteinase domain of FX

2.5 Western blotting檢測(cè)香魚(yú)血清中FX的含量變化

取4、8、12、16、24、36 h和對(duì)照香魚(yú)血清蛋白進(jìn)行Western blotting分析, 在血清中檢測(cè)到相對(duì)分子質(zhì)量為4.81×104的條帶(圖5 b)。與健康對(duì)照相比, 4 h時(shí), 鰻利斯頓氏菌侵染的香魚(yú)血清中FX的含量未發(fā)生明顯變化; 8 h后含量顯著增加(P＜0.05), 并隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)含量持續(xù)增加, 8 h時(shí)為對(duì)照組的2倍, 36 h時(shí)為對(duì)照組的3.68倍 (圖6)。

3 討 論

FX廣泛存在于脊椎動(dòng)物中。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序結(jié)合RACE的方法, 成功獲得了香魚(yú)FX基因cDNA全長(zhǎng)序列, 這是香魚(yú)FX基因cDNA 序列的首次報(bào)道。推測(cè)的編碼蛋白具有γ-羧基谷氨酸結(jié)構(gòu)域、EGF-like 結(jié)構(gòu)域和絲氨酸蛋白酶等動(dòng)物FX特征性結(jié)構(gòu)域, 它與其它物種的氨基酸同一性小于53%。香魚(yú)FX基因mRNA主要在肝組織中表達(dá), 這與哺乳類等物種的報(bào)道結(jié)果一致 (Pendurthi et al, 1997; Heidtmann & Kontermann, 1998; Borensztajn et al, 2008)。氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析揭示, 香魚(yú)FX 與斑馬魚(yú)FX的進(jìn)化相關(guān)性最高,且與其它物種FX的進(jìn)化關(guān)系與動(dòng)物本身的進(jìn)化分類相吻合, 揭示了FX在進(jìn)化過(guò)程中的保守性。

圖6 香魚(yú)血清FX Western blotting檢測(cè)Fig. 6 Western blotting analysis of ayu serum

鰻利斯頓氏菌是養(yǎng)殖香魚(yú)出血性敗血癥的主要病原之一, 由其引起的病害給香魚(yú)產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失 (Li et al, 2009)。本實(shí)驗(yàn)研究表明, FX基因的mRNA表達(dá)及血清中FX的蛋白含量變化均與鰻利斯頓氏菌侵染香魚(yú)的過(guò)程緊密相關(guān), 這在魚(yú)類中是首次報(bào)道, 揭示了 FX很可能在魚(yú)類抗細(xì)菌侵染的免疫反應(yīng)中起作用。結(jié)合前人對(duì)哺乳動(dòng)物FX的研究結(jié)果, 我們推測(cè)魚(yú)類 FX在此病程中的作用如下: 1) FX作為動(dòng)物內(nèi)源性和外源性凝血途徑共同通路的關(guān)鍵酶 (Krupiczojc et al, 2008), 首要功能是促進(jìn)凝血 (Borensztajn et al，2008)。細(xì)菌感染的急性期反應(yīng)特征之一是病原菌感染宿主動(dòng)物后短時(shí)間內(nèi), 宿主血液中的纖維蛋白原在凝血酶的作用下迅速形成纖維蛋白, 并于炎癥區(qū)組織間隙構(gòu)成網(wǎng)狀物或凝塊, 以阻止病原菌及其毒性產(chǎn)物的擴(kuò)散。因此, FX的表達(dá)上調(diào)可能起促進(jìn)凝血, 緩解病情的作用。我們之前對(duì)香魚(yú)抗凝血酶 (antithrombin, AT)基因的研究也表明, 到12 h時(shí), 細(xì)菌侵染組香魚(yú)的肝AT基因mRNA表達(dá)與健康組相比顯著下調(diào) (Li et al, 2011), 已知AT和FX的作用相互拮抗。因此,我們認(rèn)為侵染前期FX基因mRNA的表達(dá)上調(diào)與AT基因mRNA的表達(dá)下調(diào)的目的是一致的, 均有利于凝血系統(tǒng)發(fā)揮作用。有意思的是, 兩個(gè)基因mRNA的表達(dá)均在16 h時(shí)顯著增加, 這可能是由于凝血和纖溶系統(tǒng)過(guò)度激活容易導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)而給機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷。因此, 在 FX顯著上調(diào)的同時(shí), AT也從前期的表達(dá)下調(diào)轉(zhuǎn)變?yōu)轱@著上調(diào), 兩者的作用相互拮抗, 以避免凝血系統(tǒng)的過(guò)度激活。2) 哺乳動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn), FXa能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL-6和MIF的表達(dá) (Cirino et al, 1997; Papapetropo ulos et al, 1998; Shimizu et al, 2004 ); 或參與激活補(bǔ)體系統(tǒng)C3 (Amara et al, 2008)。一些魚(yú)類研究也表明病原菌感染后, IL-6、C3和MIF的表達(dá)量均上調(diào) (Bird et al, 2005; Chen et al, 2008; Wang, 2010), 我們抑制消減雜交的結(jié)果也表明鰻利斯頓氏菌侵染8 h后, 香魚(yú)肝組織中補(bǔ)體系統(tǒng)成分, 如 C4、C5、C8、C9、Cfh、Cfb等基因 mRNA均顯著表達(dá)上調(diào) (結(jié)果未發(fā)表)。然而,魚(yú)類 FX是否介導(dǎo)病原菌感染后上述細(xì)胞因子及補(bǔ)體系統(tǒng)成分的表達(dá)增加尚有待于進(jìn)一步證明。

綜上所述, 本研究首次報(bào)道了魚(yú)類凝血因子 X基因表達(dá)與鰻利斯頓氏菌感染的相關(guān)性, 為魚(yú)類FX的結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

Amara U, Rittirsch D, Flierl M, Bruckner U, Klos A, Gebhard F, Lambris JD, Huber-Lang M. 2008. Interaction between the coagulation and complement system[J].Adv Exp Med Biol, 632: 71-79.

Bird S, Zou J, Savan R, Kono T, Sakai M, Woo J, Secombes C. 2005. Characterisation and expression analysis of an interleukin 6 homologue in the Japanese pufferfish,Fugu rubripes[J].Dev Comp Immunol, 29 (9): 775-789.

Borensztajn K, Peppelenbosch MP, Spek CA. 2008. Factor Xa: at the crossroads between coagulation and signaling in physiology and disease[J].Trends Mol Med, 14(10): 429-440.

Borensztajn K, Spek CA. 2011. Blood coagulation factor Xa as an emerging drug target[J].Expert Opin Ther Targets, 15(3): 341-349.

Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem, 72(1-2): 248-254.

Chen J, Shi YH, Li MY, Ding WC, Niu H. 2008. Molecular cloning of liver angiotensinogen gene in ayu (Plecoglossus altivelis) and mRNA expression changes uponAeromonas hydrophilainfection[J].Fish She llfish Immunol, 24(5): 659-662.

Chen Y, Guo L, Chen SF. 2008. Expression analysis on C3, C4 ofTakifugu obscurusafter injection[J].Jiangsu Agric Sci, 2: 175-177.[陳勇, 郭麗,陳舒泛. 2008. 感染后暗紋東方鲀補(bǔ)體組分C3、C4表達(dá)分析. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2: 175-177.]

Cirino G, Cicala C, Bucci M, Sorrentino L, Ambrosini G, DeDominicis G, Altieri DC. 1997.Factor Xa as an interface between coagulation and inflammation. Molecular mimicry of factor Xa association with effector cell protease receptor-1 induces acute inflammation in vivo[J].J Clin Invest, 99(10): 2446-2451.

Heidtmann HH, Kontermann RE. 1998. Cloning and recombinant expression of mouse coagulation factor X[J].Thromb Res, 92(1):33-41.

Jima DD, Shah RN, Orcutt TM, Joshi D, Law JM, Litman GW, Trede NS, Yoder JA. 2009. Enhanced transcription of complement and coagulation genes in the absence of adaptive immunity[J].Mol Immunol, 46(7): 1505-1516.

Kimura A, Lkeo K, Nonaka M. 2009. Evolutionary origin of the vertebrate blood complement and coagulation systems inferred from liver EST analysis of lamprey[J].Dev Comp Immunol, 33(1): 77-87.

Krupiczojc MA, Scotton CJ, Chambers RC. 2008. Coagulation signalling following tissue injury: Focus on the role of factor Xa[J].Int J Biochem Cell Biol, 40(6-7): 1228-1237.

Leong JS, Jantzen SG, von Schalburg KR, Cooper GA, Messmer AM, Liao NY, Munro S, Moore R, Holt RA, Jones SJ, Davidson WS, Koop BF. 2010.Salmo salarandEsox luciusfull-length cDNA sequences reveal changes in evolutionary pressures on a post-tetraploidization genome [J].BMC Genomics, 11: 279.

Li CH, Chen J, Shi YH, Li MY. 2009. Characterization ofListonella anguillarumas the aetiological agent of vibriosis occurred in cultured ayu (Plecoglossus altivelis) in Ninghai country, China [J].Acta Micriobiol Sin, 49(7): 931-937.[李長(zhǎng)紅, 陳炯, 史雨紅, 李明云. 2009.寧海地區(qū)香魚(yú)弧菌病病原菌鑒定. 微生物學(xué)報(bào), 49(7): 931-937.]

Li CH, Chen J, Shi YH, Lu XJ. 2011. Cloning, sequence analysis and mRNA expression Pattern of antithrombin gene (AT) in ayu (Plecoglossus altivelis) [J].J Agric Biotechnol, 19(1): 157-163. [李長(zhǎng)紅, 陳炯, 史雨紅, 陸新江. 2011. 香魚(yú)抗凝血酶基因 (AT) cDNA的克隆、序列分析及組織表達(dá)特征. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 19(1): 157-163]

Livak K J, Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T)) method [J].Methods, 25(4): 402- 408.

Papapetropoulos A, Piccardoni P, Cirino G, Bucci M, Sorrentino R, Cicala C, Johnson K, Zachariou V, Sessa WC, Altieri DC. 1998. Hypotension and inflammatory cytokine gene expression triggered by factor Xa–nitric oxide signaling[J].Proc Natl Acad Sci USA, 95(8): 4738-4742.

Pendurthi UR, Anderson KD, James HL. 1997. Characterization of a full-length cDNA for rabbit factor X[J].Thromb Res, 85(6): 503-514.

Pierre L St, Masci PP, Filippovich I, Sorokina N, Marsh N, Miller DJ, Lavin MF. 2005. Comparative analysis of prothrombin activators from the venom of Australian elapids[J].Mol Biol Evol, 22(9): 1853-1864.

Schoenmakers SH, Reitsma PH, Spek CA. 2005. Blood coagulation factors as inflammatory mediators[J].Blood Cells Mol Dis, 34(1): 30-37.

Shimizu T, Nishihira J, Watanabe H, Abe R, Honda A, Ishibashi T, Shimizu H. 2004. Macrophage migration inhibitory factor is induced by thrombin and factor Xa in endothelial cells[J].J Biol Chem, 279(14): 13729-13737.

Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J].Mol Biol Evol, 24(8): 1596-1599.

Uenobe M, Kohchi C, Yoshioka N, Yuasa A, Inagawa H, Morii K, Nishizawa T, Takahashi Y, Soma G. 2007. Cloning and characterizationof a TNF-like protein ofPlecoglossus altivelis(ayu fish)[J].Mol Immunol, 44(6): 1115-1122.

Wang QL. 2010. Effects of macrophage migration inhibitory factor(MIF) in fish bacterial sepsis[D]. Zhejiang University. [王渠龍. 2010. 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在魚(yú)類細(xì)菌性敗血癥中的生物學(xué)作用. 浙江大學(xué)]

Alteration on the expression of ayu coagulation factor X gene uponListonella anguillaruminfection

HUANG Zuo-An, CHEN Jiong*, LU Xin-Jiang, SHI Yu-Hong, LI Ming-Yun

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology,Ministry of Education,Ningbo University,Ningbo, 315211China)

Coagulation factor X (FX) plays an important role in the immune response of mammals. In this study, the full length cDNA sequence of the ayu FX gene, 1817 bp in length excluding 3'-polyA tail, was determined for the first time. The sequence contained an open reading frame, which encoded a protein of 453 amino acids with a molecular weight of 5.07 × 104. The predicted protein had motifs typical of animal FX, and its N-terminal 24 residues were the signal peptides. Sequence comparison showed that ayu FX shared 53% amino acid sequence identity with zebrafish FX. In healthy ayu, FX mRNA was expressed mainly in the liver and weakly in the brain and gill. AfterListonella anguillaruminfection, liver FX transcriptions significantly increased, and peaked at 16 h post infection. The serine protease motif of ayu FX was expressed inEscherichia coliand was subsequently used for antiserum preparation. Western blotting analysis revealed that serum FX significantly increased in bacterially infected ayu fish. In conclusion, the ayu FX gene expression was significant in the progress of bacterial infection, which suggests FX’s role in fish immune response.

Coagulation factor FX; Ayu;Listonella anguillarum; RT-qPCR; Western blotting

Q917.4; Q959.499

A

0254-5853-(2011)05-0492-07

D OI: 10.3724/SP.J.1141.2011.05492

2011-05-09; 接受日期:2011-07-08

長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IRT0734); 教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(NCET-08-0928); 寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010A610001)

?通訊作者(Corresponding author), Tel: 0574-87609571, E-mail: jchen1975@163.com

黃左安(1988—), 男, 浙江溫州人, 碩士生, 研究方向:水產(chǎn)分子生物學(xué); Tel: 13958231636; E-mail: hzaok@163.com