花鱸微衛星標記分離及其多態性分析

趙 燕, 季相山, 曾勇慶, 丁 雷, 楊萍萍, 王 慧

(山東農業大學 動物科技學院, 山東 泰安 271018)

花鱸微衛星標記分離及其多態性分析

趙 燕, 季相山, 曾勇慶, 丁 雷, 楊萍萍, 王 慧*

(山東農業大學 動物科技學院, 山東 泰安 271018)

該文利用FIASCO法(fast isolation by AFLP of sequences containing repeats)和GenBank數據庫搜索法開發花鱸微衛星標記, 并對篩選的標記進行多態性檢測。兩種方法共獲得54條能夠設計引物的序列, 擴增結果顯示15對引物具有多態性, 多態性微衛星位點的等位基因數為 2～10個。15個多態性位點中, 4個位點偏離了Hardy-Weinberg平衡; 各位點間沒有連鎖不平衡現象; 僅位點SP52可能存在無效等位基因; 除SP17和SP468外,其余引物的PIC值均在0.5以上, 可用于花鱸群體遺傳分析等研究。

FIASCO法; 數據庫查詢法; 花鱸; 微衛星

微衛星具有多態性豐富、易于快速檢測等特點,在種質資源保存利用、遺傳結構和遺傳變異及遺傳連鎖圖譜構建等方面的研究中發揮著非常重要的作用, 已經發展成為當前主流的分子標記之一(Wang et al, 2009)。FIASCO法(fast isolation by AFLP of sequences containing repeats)是基于AFLP技術的一種非常有效的分離微衛星位點的方法(Zane et al, 2002)。它將AFLP與雜交選擇相結合, 能夠簡單快速提高陽性率, 發展前景較大, 已經在黃鱔(Monopterus albus) (Li et al, 2007)、鱖魚（Siniperca chuatsi） (Kuang et al, 2009)等多種魚類微衛星的開發上使用。數據庫搜索法是從公用的DNA 序列數據庫(GenBank、EMBL和DDBJ等)中查找所研究物種的序列信息, 并用于開發微衛星標記的一種簡單經濟有效的方法(Brown et al, 1996)。

當前已開發的花鱸微衛星標記較少, 僅 Jiang et al (2007, 2008)發表了22個微衛星標記, 其中有13個微衛星標記為混合微衛星, 不適于種群遺傳學研究, 遠遠滿足不了花鱸遺傳育種等研究的需要。在微衛星開發的幾種方法中, 從基因組文庫中篩選,耗時、費力, 效率較低; 從近緣中擴增, 成功率較低。本研究選擇目前應用較廣泛的FIASCO法構建花鱸部分基因組文庫及參照 GenBank上花鱸的相關序列設計微衛星引物兩種方法, 對花鱸微衛星位點的多態性進行研究, 這可為花鱸群體遺傳結構的分析、遺傳資源的保護利用和分子標記輔助育種等打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用花鱸活體樣本捕自山東煙臺近海, 共30個個體, 取其尾鰭置于75%酒精中, 保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2 微衛星富集文庫的構建與序列測定

用蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提法從花鱸的鰭條中分離、純化基因組DNA (Sambrook & Russell, 2002)。

基因組DNA用限制性內切酶MseⅠ酶切后回收250～1 000 bp的片段, 回收產物與接頭oligo-MseⅠA (HO 5'-TACTCAGGACTCAT-3' OH)和oligo-MseⅠB (HO 3'-GAGTCCTGAGTAGCAG-5' OH) 連接。建立17.5 μL連接體系(接頭20 μmol/L, 2.5 μL; T4 DNA ligase 6 U, 10×buffer 1.75 μL, 純化的酶切產物 10 μL), 置16 ℃水浴中過夜連接。利用預擴引物MseⅠ- N(5'-ATGAGTCCTGAGTAAN-3')對連接了接頭的DNA片段進行PCR擴增, 程序為94 ℃預變性5 min, 94 ℃變性30 s, 53 ℃退火30 s, 72 ℃延伸 1 min, 共進行 30個循環, 最后 72 ℃延伸10 min。回收250～1 000 bp的預擴增片段用于雜交分析。

雜交體系包含生物素標記的(GT)13的探針 6.0 μL(40 μmol/L), 雜交液(6×SSC + 0.1% SDS)70 μL,預擴增回收產物 20 μL。磁珠經 250 μL的TEN100(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, pH 7.5)洗滌3次, 每次5 min后, 將雜交產物和300 μL TEN100加入到預處理過的磁珠中, 室溫反應30 min。分別用400 μL TEN1000(0.2 ×SSC + 0.1% SDS)和洗脫液(0.2×SSC + 0.1% SDS)各洗滌磁珠3次, 每次5 min, 其間不時用移液器輕輕吹打, 重懸磁珠。最后用400 μL 1×SSC洗滌磁珠5 min。加50 μL TE, 95 ℃水浴中變性5 min, 洗脫含有微衛星序列的單鏈 DNA。以洗脫的含有微衛星的單鏈 DNA為模板再次用引物MseI-N 進行擴增, 擴增程序同上, 回收 250～1 000 bp的片段。

將回收的目的片段連接到pMD18-T載體中并轉化至大腸桿菌 DH5α中, 涂平板后挑取單克隆,用引物MseI-N進行PCR檢測, 挑選陽性克隆送上海生物工程技術服務有限責任公司測序。利用DNAMAN Version 4.0 和GenBank中的Blastn軟件對測得序列進行比對, 去掉冗余序列。

1.3 GenBank數據庫搜索

輸入“Laterolabrax japonicus”作為搜索關鍵詞,在 NCBI公共數據庫(http: // www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索核苷酸序列, 下載所有相關序列以 FSATA格式保存備用。

1.4 序列分析及微衛星引物設計

利用 SSRHUNTER 1.3(http://en.bio-soft.net/ dna/SSRHunter.html)軟件, 對以上兩種方法得到的序列進行分析, 含二堿基、三堿基、四堿基重復 5次以上的為含微衛星的序列。根據微衛星的側翼序列, 利用軟件Premier 5.0設計引物, 并交由上海生物工程技術服務有限責任公司合成。

1.5 微衛星標記的多態性檢測

利用合成的引物分別在 30個花鱸個體中進行PCR擴增用于分析其多態性。PCR反應總體積為20μL , 內含20 ng的模板DNA, 0.2 μmol/L的引物, 200 μmol/L的dNTPs, 1.5 mmol/L 的Mg2+, 1 X PCR 反應緩沖液, 1 U 的Taq DNA 聚合酶。PCR反應為 30個循環, 每個循環包括: 94℃變性 30 s,退火30 s, 72 ℃延伸1 min; 首次循環前預變性5 min; 最后一次循環結束后 72 ℃再延伸 10 min。PCR 擴增產物經 6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 硝酸銀染色后數碼相機拍照保存。

1.6 數據分析

微衛星標記呈共顯性, 可直接根據每個個體產生的條帶的位置確定基因型, 利用Popgene32 處理數據, 計算多態性位點的等位基因數目、觀測雜合度(HO)、期望雜合度(HE), 并按下列公式計算多態性信息含量(PIC):

其中，Pi和Pj分別為第i和第j個等位基因的頻率,n為等位基因個數。

利用 MICRO-CHECKER Version 2.2.3軟件估計位點的無效等位基因頻率。所有多重比較均經Bonferroni校正。

2 結 果

2.1 FIASCO法篩選的微衛星標記

從構建的文庫中隨機挑取150個克隆, 利用預擴引物進行PCR鑒定, 共得到陽性克隆94個, 陽性率為62.7%; 對陽性克隆測序得到66個含微衛星序列的克隆, 陽性序列比例為70.2%。66條微衛星序列中共含微衛星座位108個, 其中CA/GT重復序列97個, 占89.8%, GA/CT重復4個, 占3.7%, 其他重復序列7個, 占6.5%。在這些含微衛星重復的序列中, 微衛星重復數在10次以上的, 占70.3%。在這些位點的重復序列中, 共3個復合型(sp52、sp416、sp468), 其他為完美型。利用 DNAMAN 4.0 和GenBank中的Blastn軟件對這66條微衛星序列進行比對, 去掉冗余序列后全部提交 GenBank, 并利用 Premier 5.0軟件共設計引物42對, 部分微衛星序列及引物信息見表1。

2.2 GenBank 數據庫搜索結果

表1 FIASCO法獲得的部分花鱸微衛星序列Tab. 1 Microsatellite sequences obtained by FIASCO

截至2010年2月, 在GenBank數據庫中共搜索到540條花鱸核苷酸序列及132條EST序列, 經SSRHUNTER 1.3軟件分析, 含微衛星的序列為22條, 其中8條為基因的全長cDNA序列; 1條為基因的部分cDNA序列; 13條為EST序列。在22條微衛星序列中含微衛星座位 29個, 其中CA/GT重復序列14個, 占48.3%,GA/CT重復10個, 占34.5%,三堿基重復序列5個, 占17.2%。在這些含微衛星重復的序列中, 微衛星重復數在10次以上的僅6個,重復數在5～7次間的為22個(75.8%)。在8條基因的全長 cDNA序列中, 微衛星座位多數位于內含子、3′-UTR、5′-UTR等區域, 僅有1個位于外顯子區域(表2)。

2.3 微衛星標記多態性分析

兩種方法篩選的微衛星序列共設計引物54對,利用8尾花鱸的DNA對各引物擴增情況作初步篩選, 發現32對能擴增出與期望PCR產物大小相等或相近的片段, 其中 15對引物的擴增片段有穩定的多態性(表3), 其余的都為單態。應用這15對引物對30個個體進行了PCR擴增, 擴增條帶清晰、穩定, 其中微衛星引物SPd10擴增產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜見圖1。

表2 GenBank數據庫查詢得到的部分微衛星序列Tab. 2 Microsatellite sequences obtained by bioinformatic screening in GenBank

在野生花鱸30個個體中, 15個花鱸多態性微衛星位點共檢測到89個等位基因, 平均每個位點5.9個等位基因, 表現出高度多態性, 各等位基因大小在141～349之間(表3)。Popgene32 分析結果顯示, 15個多態性微衛星位點的觀測雜合度在0.6000～序的微衛星序列中, CA/GT重復序列97個, 占1.0000之間, 期望雜合度在 0.5079～0.8890之間。經Bonferroni 校正后(P＜ 0.003), 各位點間沒有連鎖不平衡現象, 4個微衛星位點(SP17、SP52、 SP94 和SP468)偏離了 Hardy-Weinberg平衡。MICROCHECKER 2.2.3軟件分析表明僅位點SP52可能存在無效等位基因。同時, 對 15對微衛星引物的多態性信息含量(PIC)進行了評估, SP17位點提供的信息含量為 0.4189; SP468為 0.3747, 其余引物的PIC值均在0.5以上, 可用于花鱸群體遺傳分析等研究。

圖1 微衛星標記SPd10在花鱸30個個體中的擴增圖譜Fig. 1 Amplification results of microsatellite locus SPd10 in 30 Lateolabrax japonicus individuals

表3 15個多態性花鱸微衛星標記分析結果Tab. 3 Characteristics of 15 polymorphic microsatellite markers in Lateolabrax japonicus

3 討 論

目前開發微衛星標記的方法很多, 概括起來有3種: (1)從基因組文庫中篩選微衛星; (2)從數據庫或有關文章中查詢; (3)從近緣物種中篩選微衛星(Zhan et al, 2008)。本文研究發現, 數據庫搜索法得到的花鱸微衛星位點的多態率為 41.7%, 多態性較高。其他的研究也得到類似的結果, 如Ji et al(2009)搜索 GenBank數據庫中的牙鲆(Paralichthys olivaceus)全cDNA序列, 得到15個具有高多態性的微衛星位點, 多態率為 46.8%; Furukawa et al (2004)用同樣的方法搜索到11個具有多態性的河豚微衛星位點, 多態率為73%。從數據庫中查找微衛星位點, 雖然省時省力, 但受限于數據庫中提交序列的數量, 多數物種因提交的序列較少只能開發出有限的多態性微衛星標記。FIASCO法是Zane et al (2002)年提出的一種高效的篩選微衛星標記的方法。此法一經提出, 便被迅速廣泛地應用于許多物種的微衛星位點的篩選(Reed et al, 2001)。本文利用FIASCO法構建了花鱸(GT)13的微衛星富集文庫,在所有測序的微衛星序列中，CA/GT重復序列 97個，占89.8%。而通過傳統的篩選小插入片段基因文庫的方法分離微衛星標記, 得到的陽性克隆比例極低(0.1%～6.4%, 平均1.96%) (Zane et al., 2002)。

雖然微衛星可分布于基因組的任何地方, 但是在真核生物中, 微衛星位于非編碼區的頻率遠高于位于編碼區的(Toth et al, 2000)。本文研究發現, 在花鱸8條基因的全長cDNA序列中, 微衛星座位多數位于內含子、3'-UTR、5'-UTR等區域, 僅有1個位于外顯子區域, 占 12.5%, 這與其它脊椎動物中微衛星在外顯子區的分布頻率(9%～15%)(Moran et al, 1993; Jurka et al, 1995)基本一致。這種微衛星位點在編碼區的低頻現象可能是為了防止蛋白質翻譯時發生移碼突變的一種保護機制(Metzgar et al, 2000; Li et al, 2007)。

本研究得到的15個多態性微衛星位點中有4個(SP17、SP52、SP94和SP468)偏離了Hardy-Weinberg平衡。偏離HWE的原因有很多, 例如, 無效等位基因、檢測個體不具有代表性、交配群體等。軟件分析表明, 僅位點SP52可能存在無效等位基因, 造成其他3個位點偏離HWE的原因可能是檢測個體數目過小, 檢測的個體不具代表性等所致。

微衛星位點的多態性一般用3個指標評價: 等位基因的數目、雜合度和多態性信息含量值(PIC)。其中等位基因數目和雜合度能較好地反映群體中等位基因的豐富程度和均勻程度, 而多態性信息含量值反映了微衛星位點能夠提供的遺傳信息容量。本研究得到的花鱸 15個多態性微衛星位點共檢測到 89個等位基因, 平均每個位點 5.9個等位基因,表現出高度多態性, 且 15個多態性微衛星位點的觀測雜合度在 0.6000～1.0000之間, 期望雜合度在0.5079～0.8890之間; 而Jiang et al(2007)對22個微衛星位點的多態性分析顯示, 其觀測雜合度在0.114～0.914之間, 期望雜合度在0.111～0.938之間,這表明花鱸野生群體具有較高的遺傳多樣性。據Gu et al (2008), 當PIC＞0.5 時, 表明該遺傳標記可提供豐富的遺傳信息。本文研究結果表明, 15個花鱸多態性微衛星位點中的13個位點PIC值均大于0.5, 說明本文新開發的微衛星位點提供的遺傳信息容量大,能為群體遺傳性分析提供有力的工具。

本文利用 FIASCO法和數據庫查詢法兩種方法開發了花鱸微衛星位點 15個, 并對其多態性進行了研究, 結果表明數據庫查詢法簡便快捷, 多態性好; FIASCO法富集效率高, 適合用于花鱸微衛星標記大規模的開發。開發的多態性微衛星標記可為花鱸群體遺傳學研究、連鎖圖譜構建等提供有力的支持。

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Isolation of microsatellite markers forLateolabrax japonicusand polymorphic analysis

ZHAO Yan, JI Xiang-Shan, ZENG Yong-Qing, DING Lei, YANG Ping-Ping, WANG Hui*

(College of Animal Science and Technology,Shandong Agriculture University,Taian271018,China)

To investigate population structure and marker assisted breeding, fast isolation by AFLP of sequences containing repeats (FIASCO) and GenBank database mining were used to develop novel microsatellite markers for sea perch (Lateolabrax japonicus). Genomic DNA fragments containing SSR sequences were captured by hybridization to (GT)13biotin-labeled probe and were ligated to PMD18-T vector. Among 150 randomly chosen clones from the SSR-enriched library, 66 sequences contained microsatellite motif over five repeats. In addition, 540 cDNA sequences and 132 ESTs ofLateolabrax japonicuswere downloaded from GenBank and screened for di-, tri- and tetra-nucleotide repeats, while 22 sequences were found to contain microsatellites. As a result, 15 microsatellite loci were shown to be polymorphic in 30Lateolabrax japonicusindividuals, with the alleles ranging from two to ten, the observed heterozygosities from 0.6000 - 1.0000, and the expected heterozygosities from 0.5079 - 0.8890. Four loci (SP17, SP52, SP94 and SP468) were deviated from HWE in the sampled population after Bonferroni’s correction, and no linkage disequilibrium was found among all loci (P＜0.003), whereas null alleles were detected at locus SP52 (P＜0.05). Among 15 polymorphic loci, the PIC values, which can be used for related population genetics analysis, were all above 0.5, with the exception of SP17 and SP468.

FIASCO; Database mining;Lateolabrax japonicus; Microsatellite

Q95-33; Q959.483

A

0254-5853-(2011)05-0515-06

10.3724/SP.J.1141.2011.05515

2011-02-21; 接受日期: 2011-07-08

國家“863”計劃項目(2008AA101010); 國家發改委生物育種高技術專項(2007249051); 山東省農業良種工程重大項目(2007LZ013); 博士后創新基金項目(200703044)

?通訊作者(Corresponding author)，王慧(1963 - ), 女, 教授, 博導,Tel: 13001771684; E-mail: wanghui2328@sdau.edu.cn