嗜熱四膜蟲五個hsp70基因的表達分析

馮立芳, 暢 悅, 袁冬霞 繆 煒

(1. 中國科學院水生生物研究所 水生生物多樣性與保護重點實驗室, 湖北 武漢 430072;

2. 浙江工商大學 食品與生物工程學院, 浙江 杭州 310012; 3. 中國科學院研究生院, 北京 100049)

嗜熱四膜蟲五個hsp70基因的表達分析

馮立芳1,2, 暢 悅1,3, 袁冬霞1, 繆 煒1,*

(1. 中國科學院水生生物研究所 水生生物多樣性與保護重點實驗室, 湖北 武漢 430072;

2. 浙江工商大學 食品與生物工程學院, 浙江 杭州 310012; 3. 中國科學院研究生院, 北京 100049)

鑒定得到嗜熱四膜蟲13個含有完整保守結構域的hsp70基因, 對其中5個高度相似且無內含子的hsp70基因進行表達分析。在37 、39 和41 ℃熱激條件下, 實時熒光定量PCR結果表明,hsp70-2基因對熱激響應最敏感。在四膜蟲生長、饑餓和接合生殖這3種生理或發育狀態下, Microarray結果顯示,hsp70-4基因恒定且高表達; 在熱激條件下,hsp70-4基因的表達水平隨著溫度的升高而略微增加, 證實hsp70-4基因為熱休克相關蛋白hsc70基因;克隆的hsp70-4基因全長2 208 bp, 開放閱讀框長1 959 bp, 編碼653個氨基酸。Microarray結果提示,hsp70-3可能參與四膜蟲饑餓早期(0～12 h)的耐受和接合生殖后期(6～10 h)的新大小核形成, 老大核凋亡等事件;hsp70-5可能參與四膜蟲饑餓晚期(12～15 h)的耐受和接合生殖早期(0～6 h)的小核減數分裂、小核交換和原核(pronuclear)融合事件。Blast2GO分析表明, 與hsp70-3和hsp70-5共表達的基因分別參與不同的生物學過程, 進一步反映了hsp70-3和hsp70-5這兩個基因在功能上是存在差異的。

嗜熱四膜蟲;hsp70基因; 實時熒光定量PCR; Microarray; RACE; 表達分析

熱休克蛋白(heat-shock protein, HSP)是生物適應環境變化的一個重要媒介分子, 溫度、外源有毒化合物、紫外輻射等都會誘導細胞或機體產生應激反應, 迅速合成HSP作為分子伴侶參與蛋白質的合成、折疊、裝配、運轉和降解等過程, 以維持細胞蛋白自穩, 提高細胞對應激源的耐受性, 增強抗氧化作用, 使細胞維持正常的生理功能(S?rensen et al,2003; Saibil 2008)。熱休克蛋白 70(HSP70)是 HSP家族的主要一員, 它是細胞在應激條件下的主要表達產物, 對于外源有毒化合物的響應也迅速而靈敏(Gupta et al, 2010)。根據表達情況,hsp70基因家族可分為兩類：誘導型表達的hsp70基因(heat shock protein 70,hsp70)和組成型表達的hsp70基因(heat shock cognate gene,hsc70) (Karouna-Renier et al,2003; S?rensen et al, 2003)。對生物體hsp70基因家族的研究, 可以更好地認識物種耐受脅迫的機制(Daugaard et al, 2007), 這在單細胞生物, 如真菌Chytridiomycete (Blastocladiella emersonii) (Georg &Gomes, 2007); 多細胞動物, 如線蟲Caenorhabditis elegans(Snutch et al, 1988)、果蠅Drosophila melanogaster(Bettencourt & Feder, 2001); 高等動物,如人(Daugaard et al, 2007); 植物, 如擬南芥Arabidopsis (Sung et al, 2001)等物種中已展開了研究, 但在原生動物中, 尚未有關hsp70基因家族或亞家族的相關報道。

原生動物四膜蟲Tetrahymena隸屬于纖毛門(Ciliophora)、寡膜綱(Oligohymenophorea)、膜口目(Hymenostomatida)、四膜蟲科(Tetrahymenidae)、四膜蟲屬(Tetrahymena), 是一種營自由生活的單細胞真核生物(Shen, 1999)。目前, 嗜熱四膜蟲大核基因組測序工作 (TetrahymenaMacronuclear Genome Project) 已經完成(Eisen et al, 2006), 這為從基因組水平鑒定嗜熱四膜蟲內hsp70基因家族成員奠定了基礎。此外, 近期構建的四膜蟲的全基因組基因芯片分析平臺(Miao et al, 2009)和在此基礎上建立的四膜蟲基因表達數據庫(TetrahymenaGene Expression Database, TGED, http://tged.ihb.ac.cn),為嗜熱四膜蟲內hsp70基因家族成員的功能分析增加了豐富的信息。

關于四膜蟲hsp70基因的研究主要在于不同熱激條件下hsp70基因的表達變化規律(Galego &Rodrigues-Pousada, 1985; Williams & Nelsen, 1997),或是證實 HSP70賦予嗜熱四膜蟲的高溫耐受能力(Hallberg et al, 1984, 1985), 或者是對hsp70基因上游調控元件的功能研究等方面(Barchetta et al,2008)。本研究在鑒定嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)hsp70基因家族的基礎上, 對其中5個高度相似且無內含子的hsp70基因進行表達分析,并進一步探討嗜熱四膜蟲hsp70基因的功能。

1 材料與方法

1.1 四膜蟲細胞的培養

嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)(SB210株)由美國加州大學圣巴巴拉分校Eduardo Orias教授惠贈, 嗜熱四膜蟲(B2086株和CU428株)由美國康奈爾大學Peter Bruns教授惠贈。四膜蟲的培養基組分：2% Proteose Peptone (Difco)、0.1% yeast extract(Oxide)、0.2% 葡萄糖(國藥集團)、0.003%Ferric citrate(Sigma), 溶于雙蒸水, 經 103 kPa、120 ℃滅菌20 min后冷卻至室溫。取長勢良好的對數生長期四膜蟲按總體積的 0.2% (400 μL)接種于20 ml培養基中, 30 ℃連續傳代培養。

1.2 嗜熱四膜蟲hsp70基因的鑒定

在 5 μg/L濃度三丁基錫(Tributyltin, TBT)(Acros Organic)處理嗜熱四膜蟲CU428株24 h后,用 cDNA microarray篩選得到 1個應激響應基因hsp70 ——TTHERM_00125640 (Microarray數據未發表)。根據該基因的 ID號, 在四膜蟲基因組數據庫TGD(http://www.ciliate.org/)中進行搜索得到預測基因所編碼的氨基酸序列。以此基因的氨基酸序列為基礎, 并添加人、酵母和擬南芥的 HSP70序列,對四膜蟲全基因組數據庫進行Blastp搜索(Altschul et al, 1997); 得到的結果再次對四膜蟲基因組進行Blastp搜索以找到四膜蟲中所有的潛在hsp70基因。兩次所得搜索結果在 NCBI的 CDD數據庫——Conserved Domain Database (Marchler-Bauer et al,2009)以及Pfam數據庫(Finn et al, 2010)中再次進行比對, 對具有 HSP70保守結構域的基因進行鑒定,最后總共得到了 13個具有完整保守結構域的嗜熱四膜蟲hsp70基因。將這13個hsp70基因的核酸預測序列與嗜熱四膜蟲轉錄組測序結果(數據未發表)進行比對校正。

1.3 序列比對及系統發育樹的構建

對鑒定得到 13個hsp70基因, 使用 Muscle(Edgar,2004)和 Mafft(Katoh & Toh, 2008)進行序列比對, 并輔以手工微調。接著用 Trimal(Capella-Gutierrez et al, 2009)對gap超過80%的氨基酸比對位點進行刪除。系統發育樹用FastTree(Price et al,2010)構建, 參數設置-pseudo、-spr 4、-mlacc 2以及-slownni。我們對四膜蟲系統發育樹中一枝含有 5個高度相似且無內含子的基因進行分析, 并將它們分別命名為hsp70-1(TTHERM_01044390)、hsp70-2(TTHERM_00125640)、hsp70-3(TTHERM_01080440)、hsp70-4(TTHERM_00105110)、hsp70-5(TTHERM_00558440)。

1.4 熱/冷激脅迫處理

溫度脅迫采用熱激和冷激兩種方式, 每組設 3個平行樣。熱激處理條件為：將裝有1 mL對數生長期嗜熱四膜蟲(SB210株)的離心管分別在37 ℃、39 ℃和41 ℃的水浴熱激, 經過30 min熱激誘導后于相應溫度下離心富集蟲體。冷激條件為：將裝有1 mL對數生長期嗜熱四膜蟲(SB210株)的離心管分別在15 ℃水浴和0 ℃冰上冷激, 經過30 min冷激誘導后于相應溫度下離心富集蟲體。

1.5 RNA提取、cDNA合成、mRNA純化、SMART cDNA文庫構建、5'和3'RACE及產物克隆測序

從上述步驟(1.4節)熱激處理條件下的嗜熱四膜蟲(SB210株)中提取總RNA, 提取方式參照試劑盒TRIzol Reagent (Invitrogen)的說明步驟, 總RNA最終溶于50 μL以DEPC處理過的雙蒸水中, 分光光度計(Malcom)和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測總RNA濃度和質量。總RNA反轉錄成cDNA的方法參見Feng & Miao(2008)。

將5 mL嗜熱四膜蟲(SB210株)在39 ℃熱激1 h后提取總RNA, 接著以PolyAtract? mRNA純化系統(Promega, Madison, WI)按照使用說明進行磁珠法純化, 純化后的mRNA使用SMART cDNA文庫構建試劑盒(Clontech Laboratories, Inc.)擴增合成cDNA文庫(Guo et al, 2010)。

根據步驟上述1.2節中鑒定得到的嗜熱四膜蟲hsp70基因序列, 設計擴增5個高度相似hsp70基因的實時熒光定量PCR引物; 根據SMART cDNA文庫構建試劑盒提供的接頭全長序列設計一對通用引物 UTR(表 1)。用正向通用引物與反向 hsp70-4引物擴增hsp70-4基因5'RACE序列, 用反向通用引物與正向hsp70-4引物擴增hsp70-4基因3'RACE序列：2.5 μL 10×buffer, 0.5 μL10 mmol/L dNTP(Fermentas), 0.4 μmol/L 引物, 1 unit Taq酶(BD advantage)混合, 0.5 μL文庫cDNA模板, 最后用雙蒸水配成25 μL RACE反應體系; RACE反應按照下列程序進行：94 ℃ 1 0 min預變性, 94 ℃ 3 0 s, 62℃30 s, 72 ℃ 1 min共35個循環反應, 最后于72 ℃延伸10 min。

PCR產物在 1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳后,特異DNA片段用glass milk膠回收試劑盒(Biostar,Canada)回收, 產物連接到 pGEM-T載體(Promega)多克隆位點, 之后轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞液中, 涂平板挑斑。篩選出的陽性克隆菌液交由上海聯合基因研究院測序。

表1 RT-PCR擴增5個hsp70基因所使用的引物Tab. 1 Primer sequences used for RT-PCR amplification of 5 hsp70 genes

1.6 實時熒光定量PCR

以上述步驟1.5節中得到的總RNA反轉錄生成的 cDNA 為模板, 用表 1的 hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-4、hsp70-5引物進行實時熒光定量PCR擴增, 內參基因選擇嗜熱四膜蟲18SrRNA基因。實時熒光定量PCR反應體系：2.5 μL 10×buffer,0.5 μL 10 mmol/L dNTP, 0.4 μmol/L 引物, 1.2 μL EvaGreen (Biotium), 1 unit Hot start Taq 酶 (天為時代), 最后以雙蒸水配成25 μL PCR反應體系。實時熒光定量PCR反應條件為：94 ℃ 5 min預變性, 中間40個循環的94 ℃ 10 s, 50 ℃ 10 s, 72 ℃ 20 s,70℃讀板1 s, 接著72 ℃ 10 min延伸, 最后制作融解曲線65～90 ℃, 以0.5 ℃/s速率讀取數據。每個樣品設置3個平行樣, 用Chromo4?實時熒光定量PCR擴增儀(Bio-Rad)進行擴增, 反應結果數據由程序 Opticon 2讀取?；虻南鄬Ρ磉_水平用軟件Relative Expression Software Tool進行計算(Pfaffl et al, 2002)。統計方法采用軟件自帶的 ANOVA法,P＜0.05為有統計學意義。實時熒光定量 PCR分析方法參考Feng et al (2007)。

1.7 共表達基因分析

根據嗜熱四膜蟲3種典型生理/發育狀態(生長、饑餓和接合生殖)20個階段的全基因組基因表達數據(數據來源于 TGED), 通過計算所有基因表達譜間的相關系數分別得到了四膜蟲hsp70-3和hsp70-5基因的共表達基因(相關系數＞0.9) (Miao et al,2009)。然后對找到的候選基因用 Blast2GO進行gene ontology (GO)術語(term)的注釋, 分析共表達基因之間的關系, 進而推測hsp70-3和hsp70-5基因的功能。

2 結 果

2.1 嗜熱四膜蟲hsp70基因的鑒定與系統發育分析

在TBT脅迫條件下用Microarray篩選到一個應激響應基因hsp70(TTHERM_00125640), Microarray信號顯示其表達上調4.4倍。以該預測hsp70基因所編碼的氨基酸序列為基礎, 經 blast比對共得到13個含有完整保守結構域的嗜熱四膜蟲hsp70基因,進一步結合嗜熱四膜蟲轉錄組測序結果(數據未發表)對這 13個基因的剪接位點和核酸序列進行校正。

對鑒定得到的13個嗜熱四膜蟲hsp70基因構建系統發育樹, 結果顯示有5個hsp70基因聚成一個小的進化枝(圖 1), 這 5個hsp70基因均無內含子,由它們推導的氨基酸序列比對如圖2所示, 兩兩之間的相似度為67.5%～76%。

圖1 最大似然法構建的嗜熱四膜蟲hsp70基因家族不同基因型的系統發育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Tetrahymena thermophila hsp70 gene family members using a ML method

2.2 熱激條件下5個hsp70基因的表達水平變化

在37 ℃、39 ℃、41 ℃熱激條件下,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-4、hsp70-5這5個基因的表達水平高于正常生長時期的 30 ℃(圖 3)。除hsp70-4外, 其余4個hsp70基因的表達水平并不隨著溫度的升高而增加, 在 41 ℃時它們的表達水平要低于39 ℃。在37、39、41 ℃這3個不同熱激條件下,hsp70-2對熱激響應最敏感, 其表達水平在5個hsp70基因中是最高的, 分別比對照組30 ℃時的表達水平高12、82和15倍。

2.3 冷激條件下5個hsp70基因的表達水平變化

以四膜蟲正常生長條件 30 ℃為對照, 分別以15 ℃和0 ℃冷激作為刺激條件, 對5個hsp70基因的表達水平進行考察。結果顯示, 除hsp70-4外, 其余4個hsp70基因對冷激都不響應(結果未顯示)。在不同的冷激條件下,hsp70-4基因的表達水平呈現為截然不同的規律：在15 ℃冷激30 min后hsp70-4表達水平提高了1倍, 但是在0 ℃冷激30 min后hsp70-4表達水平卻降低了50%(圖4)。

2.4 3種四膜蟲典型生理/發育時期下5個hsp70基因的表達水平變化

根據四膜蟲基因表達數據庫(Tetrahymenagene expression database, TGED, http://tged.ihb.ac.cn)提供的四膜蟲在 3種典型生理/發育時期下的基因表達情況, 可將5個hsp70基因分為兩大類：(1) 恒定且高表達的基因,hsp70-4基因在四膜蟲生長、饑餓及接合生殖時期表達穩定且表達量非常高,Microarray信號值在32 815～61 446之間; (2) 差異表達的基因, 為hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-5這4個基因：① 在生長時期,hsp70-3的信號值在141～209, 有較低的表達水平, 而hsp70-1、hsp70-2、hsp70-5這 3個基因不表達(信號值＜100); ② 在饑餓時期的0 h,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3這3個基因表達量較生長后期(～1×106cells/mL)分別調高42.6、15、33.6倍, 其中hsp70-3基因的信號值最高,為7 022; 在饑餓時期的0～12 h,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3表達水平的變化趨勢由高至低,hsp70-5幾乎不表達; 在饑餓時期的12～15 h,hsp70-5表達水平上調, 而hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3的表達水平仍持續下降; 在饑餓時期的 15～24 h,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-5這4個基因的表達都下降; ③ 在接合生殖時期的0～6 h, 僅hsp70-5高表達;在接合生殖時期的6～10 h,hsp70-5表達水平下降了80%,hsp70-3表達水平迅速上調16.6倍,hsp70-2表達水平上調 2.4倍; 在接合生殖時期的 10～12 h,hsp70-3表達水平下降了68.75%, 但hsp70-2表達水平持續上調 2.4倍; 在接合生殖時期的 12～18 h,hsp70-2表達水平下降了81.8%,hsp70-1表達水平上調2.1倍(圖5)。

圖2 5個hsp70基因推導的氨基酸序列比對Fig. 2 Multiple sequence alignment of the HSP70

2.5 嗜熱四膜蟲hsc70基因的克隆

嗜熱四膜蟲hsp70-4基因在四膜蟲的正常生長條件下即高表達, 而且熱激后其表達量進一步提高,屬于典型的熱休克相關蛋白hsc70基因。從嗜熱四膜蟲全長 cDNA文庫中克隆了hsc70基因的全長 cDNA,hsc70無內含子, 其開放閱讀框長2 208 bp, 編碼653個氨基酸, 5'和3'非翻譯區分別為94 bp和155 bp; 在3'非編碼區存在纖毛蟲特有終止信號(ATTTA和AATTAA) (Boldrin et al, 2003) (圖6)。

2.6 共表達基因分析

計算得到與嗜熱四膜蟲hsp70-3和hsp70-5共表達的基因分別有18個和392個, 用Blast2GO對它們的功能進行注釋, annotation結果分別成功得到10個(55.6%)和165個(42.1%)與GO terms相關的基因, 它們所參與的生物學過程分別有16種和113種,其中有8種生物學過程是重疊的(圖7)。

圖3 實時熒光定量PCR比較嗜熱四膜蟲5個hsp70基因在亞致死熱激條件下(37、39及41℃)的表達水平變化Fig. 3 Comparative expression analysis of 5 hsp70 genes inTetrahymena thermophila treated with heat shock (37,39, and 41℃) using real time quantative PCR

圖4 實時熒光定量PCR考察嗜熱四膜蟲hsp70-4基因在冷激條件下(15 ℃與0 ℃)的表達水平變化Fig. 4 Comparative expression analysis of hsp70-4 genes in Tetrahymena thermophila treated with cold shock(15℃ and 0 ℃) using real time quantative PCR

3 討 論

3.1 嗜熱四膜蟲內存在五個結構高度相似的hsp70基因

圖5 5個hsp70基因的表達譜Fig. 5 Expression profile of 5 hsp70 gene

圖6 嗜熱四膜蟲hsc70基因的cDNA序列及推導的氨基酸序列Fig. 6 The cDNA and deduced amino acid sequence of Tetrahymena thermophila hsc70 gene

圖7 維恩氏圖顯示與hsp70-3和hsp70-5共表達基因所參與的生物學過程比較Fig.7 Venn-Diagram showing the comparison of biological processes between the co-expressed genes with hsp70-3 and hsp70-5

熱休克蛋白HSP70在細胞中行使多種功能, 包括蛋白折疊、多聚體的耦合與解離、蛋白跨膜定位、熱激響應等, 為順利實現上述功能, 真核細胞的基因組往往編碼多個HSP70蛋白(Lindquist & Craig,1998)。目前在人(Daugaard et al, 2007)、果蠅(Drosophila melanogaster)(Bettencourt & Feder,2001)、線蟲(Caenorhabditis elegans)(Snutch et al,1988)、擬南芥Arabidopsis (Sung et al, 2001)、真菌Chytridiomycete(Blastocladiella emersonii) (Georg &Gomes, 2007)等中均已鑒定到由多個hsp70成員組成的基因家族。但是有關原生動物hsp70基因家族或亞家族的信息匱乏, 尤其是模式生物四膜蟲中,在大核基因組測序工作完成前僅對個別hsp70的功能進行分析(Hallberg et al, 1984; Galego & Rodrigues-Pousada, 1985; Williams & Nelsen, 1997; Barchetta et al, 2008)。

本研究鑒定得到了 13個具有完整保守結構域的嗜熱四膜蟲hsp70基因, 系統發育分析表明, 其中有5個基因聚成一個小的進化枝(圖1)。推測這5個基因可能來源于基因的近期復制事件, 類似于四膜蟲內已發現的其它基因家族的進化方式(Fu et al,2009)。真核生物細胞質中的HSP70末端4個氨基酸組成高度保守, 無論是植物, 如擬南芥, 或是低等生物, 如果蠅, 還是高等動物, 如大鼠、牛、人等均由 EEVD組成, 以維持 mRNA的轉錄順利完成(Kiang & Tsokos, 1998; Chou et al, 2003)。但在嗜熱四膜蟲內這5個高度相似的HSP70末端4個氨基酸組成卻為 DEVD, 亦不同于原核生物E. Coli的EEVKDKK, 推測四膜蟲內HSP70成員的具體功能可能有別于其它真核生物。進一步對這5個hsp70基因推導的氨基酸序列進行比對, 發現N端相對分子質量為 44 kDa的 ATPase功能域(ATP-binding domain)的序列幾乎一致, 而 C端相對分子質量為18 kDa的多肽結合功能域 (polypeptide-binding domain) 和相對分子質量為10 kDa 的C端結構域(C-terminal domain)的相似度則稍低(圖2)。作為行使 ATP水解活性區域的 ATPase功能域(Kiang &Tsokos, 1998), 5個HSP70蛋白序列的高度保守, 推測它們可能都具有水解ATP的功能; 而行使HSP70定位的C端相對分子質量為18 kDa的多肽結合功能域 (Wang et al, 1993; Demand et al, 1998)在5個HSP70蛋白序列中差異較大, 尤其是起自偶聯作用的相對分子質量為10 kDa的C端結構域(Chou et al,2003)差異更大, 說明這5個蛋白在四膜蟲細胞內行使的具體功能可能是有所差異的。

3.2 hsp70-2對熱激響應最敏感

之前的研究表明, 嗜熱四膜蟲在41 ℃熱激15 min后即可檢測到hsp70基因的表達產物, 在41 ℃熱激1 h后HSP70蛋白表達量趨于穩定(Williams &Nelsen, 1997; Hallberg et al, 1985); 但是,hsp70-1至hsp70-5這5個基因的mRNA表達水平在15～30 min達到最高值, 在 1 h后其表達量反而下降(Dr.Sabrina Barchetta, personal communication)。因此,本研究采用熱激30 min來研究上述5個hsp70基因的表達水平。

在37 ℃、39 ℃、41 ℃熱激條件下, 5個hsp70基因的表達水平均高于正常生長時期的 30 ℃, 其中以hsp70-2基因的表達水平為最高。推測嗜熱四膜蟲對熱激的響應主要依賴于hsp70-2基因, 其它4個hsp70基因起到輔助作用。這在酵母胞質hsp70基因——Ssa亞家族中已有類似的系統研究,Ssa亞家族的成員之間功能雖然有重疊, 但是每個 Ssa蛋白只在特定條件下行使功能, 其它成員只是起補償作用(Craig et al, 1993)。嗜熱四膜蟲(T. thermophila)是一種迄今為止所有已知四膜蟲屬內耐熱能力最高的物種(Nanney & Simon, 2000)。如實驗室常用的梨形四膜蟲(T. pyriformis)在32 ℃即無法繁殖生存,而嗜熱四膜蟲在40 ℃時仍能很好地存活(Frankel &Nelsen, 2001)。推測,hsp70-2基因在嗜熱四膜蟲具有高耐熱能力中可能起到主要作用。

3.3 鑒定得到的hsp70-4是一個熱休克相關蛋白基因

在以15 ℃和0 ℃冷激條件下, 僅hsp70-4對冷激有響應, 其余4個hsp70基因的mRNA表達產物均檢測不到, 說明并不是所用的嗜熱四膜蟲hsp70基因對冷激有響應。在果蠅中也同樣如此,hsp70Aa對冷激響應最敏感, 而hsp60、hsp67Ba、hsc70-1這3個基因在冷激條件下無表達產物(Colinet et al, 2010)。

考察四膜蟲在 3種典型生理/發育時期下的hsp70基因表達情況, 發現hsp70-4基因在四膜蟲的生長、饑餓及接合生殖時期表達穩定, 表達量非常高; 此外, 在 37 ℃、39 ℃、41 ℃熱激條件下,hsp70-4的表達水平隨溫度的升高而進一步提高,據此認為該基因屬于典型的組成型表達的熱休克蛋白(Karouna-Renier et al, 2003; S?rensen et al,2003), 也稱為熱休克相關蛋白(heat shock cognate protein, hsc)。這是迄今為止在四膜蟲內發現的首個hsc70。而hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-5這4個基因在生長時期表達量低或不表達, 在熱激條件下誘導高表達, 屬于誘導型表達的熱休克蛋白。

3.4 hsp70-3與hsp70-5在四膜蟲生理/發育狀態下

行使不同的功能

在四膜蟲的饑餓初期0 h,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3這 3個基因的表達量迅速調高, 其中以hsp70-3基因的信號值最高, 而hsp70-5卻不表達;隨著饑餓時間的延長, 在 12～15 h的饑餓階段,hsp70-5的表達量才開始上升, 但此時hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3的表達量都已經明顯下降。這說明饑餓處理會誘導四膜蟲hsp70基因的表達。這與在其它生物體內發現的現象是一致的, 無論是單細胞生物, 如酵母, 還是脊椎動物, 如露斯塔野鯪魚(Labeo rohita), 饑餓導致它們體內的hsp70基因表達上調(Chughtai et al, 2001; Yengkokpam et al,2008)。另一點值得注意的是, 不同的饑餓時間段對應不同的hsp70基因表達, 0～12 h主要是hsp70-3起表達, 12～15 h則是hsp70-5在表達, 提示hsp70-3和hsp70-5這兩個基因在功能上是有差異的。

Hsp70基因不僅可以被熱激、饑餓等所誘導表達, 而且也會在發育時期表達, 真菌(B. emersonii)的hsp70基因即屬于此類(Bonato et al, 1987)。在四膜蟲接合生殖時期,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-5的表達均發生變化, 其中hsp70-3和hsp70-5的表達水平最高, 變化最明顯。在接合生殖時期的0～6 h, 以hsp70-5表達為主, 此階段四膜蟲細胞內的小核通過有絲分裂產生單倍體小核, 并發生小核交換和原核(pronuclear)融合事件; 在 6～10 h,hsp70-5表達水平下降, 而hsp70-3表達水平迅速上調, 此階段四膜蟲細胞內的融合核發育成新的大核和新的小核, 老大核凋亡(Cole et al, 1997; Cole &Soelter, 1997)。

根據嗜熱四膜蟲3種典型生理/發育狀態(生長、饑餓和接合生殖)20個階段的全基因組基因表達數據, 計算得到與hsp70-3共表達的基因有18個, 其中10個是與GO terms相關的基因, 參與16種生物學過程; 與hsp70-5共表達的基因有 392個, 其中165個是與GO terms相關的基因, 參與113種生物學過程。對這兩類基因各自所參與的生物學過程進行比較, 發現其中有8種過程是重疊的, 涉及DNA代謝、DNA修復、翻譯后蛋白修飾、蛋白修飾、胞內蛋白運輸、離子運輸、磷酸化、羧酸代謝過程等,這些生物學過程可能與四膜蟲受饑餓脅迫或接合生殖時期細胞分化、發育是相關的。進一步對這兩類基因有差異的生物學過程進行比較, 發現與hsp70-3共表達的基因主要參與脂肪酸氧化、脂肪酸代謝、脂肪酸分解、羧酸分解、脂修飾、脂氧化、細胞脂肪分解等過程; 而與hsp70-5共表達的基因則主要參與細胞周期檢驗點控制、細胞形態發生、有絲分裂中期板匯集、有絲分裂M期、減數分裂、RNA代謝、RNA分解、mRNA代謝等過程。上述結果顯示hsp70-3和hsp70-5在饑餓和接合生殖階段的表達譜顯著不同, 以及與它們共表達基因所參與的生物學過程亦存在差異, 說明hsp70-3和hsp70-5這兩個基因在功能上是存在差異的。

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Expression analysis of 5hsp70genes inTetrahymena thermophila

FENG Li-Fang1,2, CHANG Yue1,3, YUAN Dong-Xia1, MIAO Wei1,*

(1. Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation,Institute of Hydrobiology,theChinese Academy of Sciences,Wuhan430072,China;
2.College of Food Science and Biotechnology,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou310035,China;3.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China)

Thirteenhsp70genes with complete conserved domains were identified inTetrahymena thermophila, and expression of five similar and non-intronhsp70genes were analyzed. Under heat shock conditions of 37, 39 and 41oC,hsp70-2mRNA had the highest relative expression level, suggesting it is closely related to heat shock. The basal level of constitutiveT. thermophilahsp70-4gene was high during 20 physiological/developmental stages of growth, starvation and conjugation, and it changed little upon exposure to heat shock: evidence thathsp70-4is an hsc70 gene. Thehsp70-4cDNA is 2 208 bp long, and contains an open reading frame of 1 959 bp encoding 635 amino acids. Microarray data indicated thatT. thermophilahsp70-3gene probably participated in early starvation (0–12 h) stress and late conjugation(6–10 h) events, such as new macronuclear and micronuclear anlagen formation and old macronuclear elimination.However,hsp70-5gene possibly participates in late starvation (12–15 h) stress and early conjugation (0–6 h) events such as micronuclear meiosis, micronuclear exchange and pronuclear fusion. Blast2GO indicated that they participated in dissimilar biological processes, suggestinghsp70-3andhsp70-5perform different functions.

Tetrahymena thermophila; Real time quantitative PCR; Microarray; RACE; Expression analysis

Q959.117; Q786

A

0254-5853-(2011)03-0267-10

10.3724/SP.J.1141.2011.03267

2010-10-13；接受日期：2011-02-22

中國科學院知識創新項目(KSCX2-EW-G-6-4); 國家自然基金資助項目(31071993)?

Corresponding author)，E-mail: miaowei@ihb.ac.cn; miaowei530@yeah.net