ephrinB2真核表達載體的構建及其在Hela細胞的表達

謝秋群，唐雄志，王世宣

（1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院婦產科，湖北 武漢 430030；2.桂林市人民醫院婦產科，廣西 桂林 541002）

ephrinB2真核表達載體的構建及其在Hela細胞的表達

謝秋群1,2，唐雄志1，王世宣2*

（1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院婦產科，湖北 武漢 430030；2.桂林市人民醫院婦產科，廣西 桂林 541002）

目的 構建ephrinB2重組真核表達載體，研究該質粒在細胞中的表達，為研究ephrinB2對腫瘤生長及血管生成的影響奠定基礎。方法 逆轉錄獲得人ephrinB2全長cDNA序列，連接到pEGFPN1上，轉化大腸桿菌，脂質體轉染Hela細胞。RT-PCR檢測轉錄情況，WB鑒定目的蛋白表達。結果 酶切和測序證實正確構建重組質粒，并在Hela細胞中表達。結論 成功構建了pEGFPN1-ephrinB2真核表達載體，并在Hela細胞中有效表達，為進一步研究ephrinB2的功能奠定基礎。

ephrinB2；載體構建；蛋白表達

ephrinB2及其受體EphB4是目前已知的酪氨酸蛋白激酶受體家族中最大的一個亞家族Eph/ephrin家族成員之一，是血管形成過程中動靜脈分化的標志，在很多腫瘤組織中都顯示高表達，與腫瘤的發展及其血管生長的關系非常密切。其對腫瘤的影響具有雙重性，既有腫瘤抑制作用，又有腫瘤促進作用。EphB4磷酸化激活后的正向信號可抑制腫瘤的發生、發展，促進腫瘤細胞凋亡，抑制其遷移、侵襲；反向信號則經ephrinB2+細胞向胞內傳遞，促進腫瘤細胞生長、增殖、遷移和侵襲[1]。近來的研究顯示EphB4和ephrinB2與婦科腫瘤有著密切的聯系，深入研究其作用機制將有利于進一步了解婦科腫瘤的發病機制、發現全新有效的靶向治療和干預途徑，有望成為腫瘤早期診斷及判斷預后的指標之一，亦可作為腫瘤治療新的靶點，有助于完善現有的腫瘤治療措施[2，3]。本研究通過構建ephrinB2基因重組真核表達質粒，并研究該質粒在真核細胞中的有效表達，為研究ephrinB2對腫瘤生長及血管生成的影響奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和細胞株：真核表達質粒pEGFPN1，宿主大腸桿菌DH5α由本實驗室保存，細胞株Hela購自美國典型培養物保藏中心（ATCC）。

1.1.2 主要試劑：RNA提取試劑TRIzol購自Gibco 公司，逆轉錄酶M-MLV 購自Promega 公司，Taq DNA聚合酶和T4連接酶為MBI公司產品，限制性內切酶HandIII和KpnI為TaKaRa公司產品，DNA膠回收試劑盒、質粒小抽試劑盒（Plasmidmini Kit）購自QIAGEN公司，細胞培養基DMEM和Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，ephrinB2抗體（sc2460）、和β-actin 抗體（ sc216162R）購自Santa Cruz 公司。小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，其余試劑購自進口或國產。

1.1.3 PCR引物設計：根據ephrinB2的mRNA（GenBank accession NM_004093）和質粒pEGFPN1（GenBank accession No:#U55762）的基因序列設計擴增ephrinB2的全長引物和檢測引物，在ephrinB2全長上下游引物的5’端分別含有限制性核酸內切酶HandIII和KpnI的酶切位點。用引物設計軟件Oligo6.10 評價設計的引物符合要求。引物合成和測序工作均由上海英駿生物技術有限公司完成。見表1。

1.2 方法

1.2.1 ephrinB2目的基因的獲得：切取2 g宮頸癌患者的癌組織，按照總RNA提取試劑盒說明書提取宮頸癌組織總RNA，并逆轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板，用上述設計的引物，在PCR 儀上進行擴增，獲得ephrinB2基因全長片段（產物應為1016bp）。PCR 條件為：預變性94℃ 5min，94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 45 s，循環30 次后72℃延伸10min。4℃保存產物，取5μL用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.2.2 重組真核表達質粒pEGFPN1 - ephrinB2的構建和鑒定：用HandIII和KpnI雙酶切分別切開pEGFPN1質粒和上述ephrinB2 PCR擴增產物，然后用DNA膠回收試劑盒回收所需要的目的基因片段。各自回收片段按摩爾數1∶5 比例混合，室溫放置5 h。將酶連產物轉化感受態E.coli DH5α菌株后轉移至含有卡那霉素的LB 瓊脂培養平板上鋪板，于37 ℃培養12～16 h 后，挑菌落進行擴增，抽提質粒DNA，經酶切初步鑒定后，進一步送Invitrogen公司測序鑒定。

1.2.3 細胞培養和基因轉染：按Invitrogen公司提供的Lipofectamine? 2000脂質體轉染操作手冊進行細胞轉染。

1.2.4 RT-PCR 檢測：轉染48 h后，分別用TRIzol試劑提取轉染pEGFPN1-ephrinB2、pEGFPN1的Hela細胞及未處理的Hela細胞的總RNA，各取2μg mRNA，按照逆轉錄酶M-M L V說明書進行逆轉錄，再取等體積c D N A模板，用ephrinB2基因的檢測引物進行PCR擴增，條件如下：94℃30 s，55.5℃ 30s，72℃ 45 s，30個循環。PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下拍照。同時PCR 擴增β-actin作為內參照。

1.2.5 Western blot 檢測：在轉染后48 h分別用三去污法提取上述三組細胞總蛋白，測定濃度后取50μg蛋白上樣，用Western blot 檢測細胞中ephrinB2蛋白的表達。具體方法如下：蛋白經SDS-PAGE 60V電泳1.5 h后轉移至硝酸纖維素（NC）膜，5 %脫脂奶37℃封閉1 h，一抗（1∶500）4℃過夜，相應二抗（1∶1000）37℃孵育1 h，顯影定影液成像，同時檢測β-actin （1∶500）的表達作為內參照。

2 結果

2.1 ephrinB2基因片段的擴增和pEGFPN1-ephrinB2重組載體的鑒定

從宮頸癌組織中擴增ephrinB2全長目的片段，大小約為1kbp，與預期一致。將重組質粒用HandIII和KpnI雙酶切，獲得兩條大小約為4.7 kb 和1kb 的片段，與載體和目的片段吻合（圖1）。經測序證實重組載體中的插入序列與目的基因序列完全匹配。

表1 相關基因的引物序列

圖1 ephrinB2基因片段的擴增和pEGFPN1-ephrinB2重組載體的鑒定

2.2 HeLa 細胞的轉染

pEGFPN1 - ephrinB2和pEGFPN1兩種質粒轉染HeLa細胞后6 h在熒光顯微鏡下可觀察到少量綠色熒光，24 h表達量明顯增加，48 h達到高峰（圖2）。

圖2 HeLa 細胞的轉染

2.3 轉染48 h后ephrinB2表達的變化

用RT-PCR檢測轉染前后ephrinB2基因的mRNA的變化，以β-actin 為內對照。結果，擴增產物電泳顯示在約200 bp處有一擴增條帶，與預期的擴增片段大小相符，pEGFPN1 - ephrinB2轉染后48 h，HeLa 細胞中ephrinB2基因的mRNA 較轉染空質粒與未處理細胞顯著增多，轉染空質粒和未處理細胞間無明顯差異（圖3）。

圖3 RT-PCR 檢測重組質粒pEGFPN1-ephrinB2在Hela細胞中的轉錄

用Western blot檢測轉染前后ephrinB2基因蛋白（37kDa）的變化，以β-actin（43kDa）為內對照，結果顯示pEGFPN1 - ephrinB2 轉染后48 h ，HeLa 細胞中ephrinB2蛋白較轉染空質粒和未處理細胞顯著增多，轉染空質粒細胞與未處理細胞間也無明顯差異 （圖4）。

圖4 pEGFPN1 - ephrinB2轉染Hela細胞表達的Western blot 分析

3 討論

迄今為止，人類的許多生物學功能和病理過程都與Ephs和ephrins有關，包括：血管形成、神經軸突導向、組織塑型、免疫調節，促進細胞增殖、遷移、分化，腫瘤發生及轉移等[4]。其中EphB4/ephrinB2信號通路因其高度的血管生成特異性及與腫瘤侵襲、轉移的相關性而成為醫學專家關注的焦點。研究顯示，若抑制腫瘤細胞EphB4的表達，可明顯減少腫瘤細胞的增殖、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤的侵襲和轉移[5]。研究Eph 受體酪氨酸激酶的生理功能及其信號傳遞途徑時往往需要其配體ephrin 的刺激活化。Ephrin 激活Eph 受體，是通過ephrin 的胞外區域與Eph 的胞外區域相互作用，誘發Eph 受體發生二聚體化[6，7]。由于ephrinB2是EphB4的特異性配體，且都為跨膜蛋白，EphB4與ephrinB2可互被對方激活，即受體與配體間的信號轉導是雙向的，一般認為ephrinB2激活EphB4為正向信號，而EphB4激活ephrinB2為逆向信號，逆向信號經ephrinB2＋細胞傳導可促進腫瘤發展[8]，故而，為了更進一步研究ephrinB2蛋白的活性，本實驗選擇ephrinB2目的片段構建質粒。

本研究通過PCR 克隆擴增了ephrinB2 有效功能基因序列，并利用基因工程技術，將該基因序列插入真核表達質粒pEGFPN1多克隆位點HandIII和KpnI之間，獲得了表達ephrinB2蛋白重組真核表達質粒pEGFPN1-ephrinB2。在利用酶切和基因測序分析顯示所構建的重組質粒pEGFPN1-ephrinB2正確的基礎上，應用細胞轉染、RT-PCR 和Western blot 技術在宮頸癌Hela 細胞中進一步證實該質粒可以有效表達目的基因ephrinB2蛋白產物。本實驗正確構建了pEGFPN1-ephrinB2 真核表達質粒，并且在Hela 細胞中有效表達目的蛋白，為研究ephrinB2 蛋白在腫瘤生長及血管生成中的作用奠定了基礎。

[1]Scehnet JS, Ley EJ, Krasnoperov V, et al.The role of Ephs,Ephrins,and growth factors in Kaposi sarcoma and implications of EphrinB2 blockade[J].Blood,2009,113(1):254-263.

[2]Kumar SR, Masood R, Spannuth WA,et al.The receptor tyrosine kinase EphB4 is overexpressed in ovarian cancer,provides survival signals and predicts poor outcome[J].Br J Cancer,2007,96(7):1083-1091.

[3]Alam SM,Fujimoto J,Jahan I,et al.Coexpression of EphB4 and ephrinB2 in tumour advancement of ovarian cancers[J].Br J Cancer,2008,98(4):845-851.

[4]Nicole K,Elena B.Paradoxes of the EphB4 Receptor in Cancer[J].Cancer Research,2007,67(9):3994-3997.

[5]Noren NK,Foos G,Hauser CA,et al.The EphB4 receptor suppresses breast cancer cell tumorigenicity through an Abl-Crk pathway[J].Nat Cell Biol,2006,8(8):815-825.

[6]Chrencik JE,Brooun A,Kraus ML,et al.Structural and biophysical characterization of the EphB4*ephrinB2 protein-protein interaction and receptor specificity[J].Biol Chem,2006,281(38):281-292.

[7]Chrencik JE,Brooun A,Recht MI,et al.Three-dimensional structure of the EphB2 receptor in complex with an antagonistic peptide reveals a novel mode of inhibition[J].Biol Chem,2007,282(50):36505-36513.

[8]Foubert P,Silvestre JS,Souttou B,et al.PSGL-1-mediated activation of EphB4 increases the proangiogenic potential of endothelial progenitor cells[J].J Clin Invest,2007,117(6):1527-1537.

Construction and in Vitro Expression of an Eukaryotic Vector Encoding ephrinB2

XIE Qiu-qun,TANG Xiong-zhi,WANG Shi-xuan
(Department of Gynecology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430030,China)

ephrinB2;vector construction;expression

R73

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2011.02.001.003.04

〔Absrract〕Objective To construct an eukaryotic plasmid expressing ephrinB2 and test whether the plasmid can be expressed in the eukaryotic cells in vitro for study the effect of ephrinB2 on tumor growth and angiogenesis.Methods The full-length ephrinB2 cDNA fragment were amplified by RT-PCR. Then the PCR product was inserted into eukaryotic fluorescent expressing vector p EGFPN1 by DNA recombinant technology and further transfected into HeLa cervical carcinoma cells. Expression of ephrinB2 in transfectants was examined by the fluorescence microscope,RT-PCR and Western blot. Results The 1kbp DNA fragment of ephrinB2 was correctly amplified. The recombinant pEGFPN1-ephrinB2 was successfully constructed and could be correctly expressed in the Hela cells. Conclusion This recombinant plasmid pEGFPN1-ephrinB2 and the resultant Hela cell model provide a basis for further study on the function of ephrinB2.

2010－12－06

桂林市科技科技成果轉化與應用項目（20080320－4）。

謝秋群（1975－），女，在職碩士，主治醫師，主要從事婦科腫瘤研究。

*王世宣（1963.9－），男，河南人，醫學博士，教授，主任醫師，主要從事婦科腫瘤學的研究工作。

紀云霞）