雌激素對缺氧／復氧心肌鈣離子的影響

鐘世剛，趙月柳，霍洪亮

（東北師范大學生命科學學院，吉林長春 130024）

雌激素對缺氧／復氧心肌鈣離子的影響

鐘世剛，趙月柳，霍洪亮

（東北師范大學生命科學學院，吉林長春 130024）

雌激素對心肌細胞缺氧／復氧損傷具有保護作用，但其保護機制尚未完全闡明.缺氧／復氧可引起心肌細胞損傷，其中發生鈣超載是心肌損傷的一個重要因素.進行了雌激素對缺氧／復氧心肌細胞內鈣離子濃度的影響研究.結果顯示：心肌細胞缺氧／復氧后細胞內鈣離子濃度明顯升高，呈復氧時間依賴性增加.雌激素有抑制缺氧／復氧心肌細胞內鈣離子濃度升高的作用，能有效防止心肌細胞鈣超載.

雌激素；缺氧／復氧；鈣超載

細胞內鈣離子（Ca2＋）參與不同酶系和各種類型細胞生理活動的調節，這些功能只需要極微量的游離鈣離子.心肌缺氧／復氧損傷可導致細胞內鈣離子水平明顯升高，產生鈣超載現象.1972年Shen和Jennings發現細胞內鈣超載在心肌缺血／灌注損傷發病機制中起主導作用［1］.在心肌缺血／灌注過程中有效抑制細胞內鈣超載是保護心肌的重要途徑之一.鈣離子拮抗劑、鈉鈣交換蛋白（sodium－calcium exchange，NCX）抑制劑均能有效減輕鈣超載的發生，減輕心肌缺血／灌注損傷，具有保護心肌細胞的作用［2－4］.有實驗表明，給雙側卵巢切除大鼠大劑量補充外源性雌激素能直接阻滯心肌細胞Ca2＋通道，產生負性肌力作用，減少心肌耗能，防止心肌細胞缺血時Ca2＋超載引起的心肌細胞壞死，保護心肌細胞的收縮功能［5］.為進一步證明雌激素對鈣超載的抑制作用，本實驗利用原代培養的乳鼠心肌細胞，采用缺氧／復氧模型模擬心肌缺血再灌注損傷，觀察了17－β雌二醇對缺氧／復氧心肌細胞內鈣離子濃度的影響，為臨床正確利用雌激素保護心血管功能提供了實驗依據.

1 材料與方法

1.1 材料

取新生1～3 d的Sprague－Dawley（SD）大鼠（吉林大學基礎醫學部實驗動物中心提供）心肌，原代細胞培養，72 h后更換無血清DMEM培養液.采用Koyama等方法配制缺氧液和復氧液，進行缺氧／復氧處理.雌激素（17－β雌二醇5μmol／L）于缺氧／復氧處理前24 h加入.

1.2 方法

1.2.1 MTT檢測

以96孔細胞培養板原代培養心肌細胞，細胞密度為5×104個／孔，每組5個復孔；空白對照孔組只有培養液不含細胞.用10%胎牛血清培養基培養72 h后，更換無血清培養基；繼續培養24 h，缺氧／復氧損傷后在培養基中加入5 g／L的MTT溶液20μL，繼續培養4 h.棄上清液，每孔加入200μL二甲基亞砜，室溫振蕩10 min，酶標儀于490 nm處讀取吸光值.

1.2.2 流式細胞儀檢測

以0.25%胰酶消化收集各組心肌細胞，用D－HANKS洗滌樣本2次后，重懸細胞于EP管中，室溫避光條件下用Fluo－3／AM（0.01 g／L）負載細胞約30 min.流式細胞儀檢測各組心肌細胞鈣離子濃度.

1.2.3 免疫熒光檢測

將Fluo－3／AM溶于二甲基亞砜中，按1 g／L配制，混勻后－20℃保存.用D－HANKS洗滌細胞玻片2次，在室溫避光條件下用Fluo－3／AM（0.01 g／L）負載細胞約30 min，再用D－HANKS沖洗細胞2～3次，熒光顯微鏡下進行觀察、拍照.

1.2.4 鈣瞬變及鈣濃度檢測

用溶解有2.5μmol／L Fluo－3和20%Pluronic F－127的臺式液37℃孵育心肌細胞30 min，再用臺式液沖洗3次洗去多余染料.利用激光共聚焦顯微鏡以線掃描的方式檢測胞內自發性鈣瞬變.用波長488 nm的氬激光激發，在560～660 nm間接收發射光，采樣速率為1.65 ms／線，沿細胞長軸縱向正中切面的中央進行掃描，然后進行圖像處理和數據分析.

1.3 統計學分析

計量資料數據用平均值±標準差表示.應用SigmaStat3.5軟件，對數據進行統計處理，應用onesamples T－Test分析或one－way ANOVA分析，P＜0.05為組間比較差異有顯著性.

2 實驗結果

圖1 MTT檢測各組心肌細胞活性變化

2.1 缺氧／復氧對心肌細胞活性的影響

如圖1所示，由于活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶使MTT溶液還原為難溶的藍紫色結晶，后者被二甲基亞砜溶解.根據490 nm處吸光值間接判斷細胞存活率，缺氧／復氧損傷組細胞活性比對照組明顯降低（P＜0.05）；雌激素組細胞活性明顯高于缺氧／復氧組（P＜0.05）.

2.2 復氧時間對細胞內鈣離子濃度的影響

如圖2所示，正常對照組心肌細胞鈣離子平均熒光強度為7.4±1.3，缺氧／復氧損傷后，鈣離子熒光值有顯著增加，并隨復氧時間延長逐漸加強，復氧1，2，4 h時分別為13.85±4.9，30.18±1.8，51.25±1.4，均明顯高于正常組，表明鈣離子濃度隨損傷組復氧時間延長顯著升高.

圖2 流式細胞儀檢測不同復氧時間組心肌細胞內鈣離子濃度變化

2.3 雌激素對細胞鈣離子濃度影響

心肌細胞鈣離子的累積光密度值正常對照組為4 376.348±18.55，缺氧／復氧（H 2 h／R 2 h）損傷組為16 280.3±27.64，明顯高于正常組（P＜0.05）；實施雌激素孵育組心肌細胞鈣離子的累積光密度值較損傷組明顯減低（P＜0.05），見圖3.

圖3 免疫熒光檢測各組心肌鈣離子濃度變化

2.4 雌激素對鈣瞬變的影響

心肌細胞自律性收縮時，細胞內鈣離子濃度是一個動態變化過程，缺氧／復氧損傷能破壞細胞內外鈣離子濃度的動態平衡.鈣瞬變檢測結果表明：缺氧／復氧組心肌細胞鈣瞬變峰值和半高寬均有增加（見圖4）.峰值反映在鈣瞬變過程中細胞內流和鈣庫肌漿網釋放鈣的最大量，半高寬（鈣信號強度超過峰值一半部分）反映鈣瞬變過程中高濃度鈣所持續的時間.缺氧／復氧損傷導致細胞鈣通透增加，細胞內鈣濃度（峰值）增加19.0%.缺氧／復氧損傷還導致細胞能量代謝障礙，影響細胞內鈣離子外排和肌質網的攝入，鈣離子在胞漿中滯留時間加長.鈣瞬變時程（半高寬）增加78.5%.Ca2＋超載能加重心肌細胞損傷.

圖4 心肌細胞鈣瞬變激光共聚焦顯微鏡檢測結果

3 討論

雌激素的抗氧化作用曾在Kim等的研究結果中得到了證明［6－7］.心肌缺氧／復氧導致細胞膜損傷，使鈣離子通透性增強，鈣離子內流增加，導致高濃度鈣離子在胞漿中滯留時間加長，鈣瞬變幅值增大，增加線粒體對鈣離子的攝取.因此，缺氧／復氧損傷破壞了細胞內能量代謝鏈，細胞膜鈣泵外排鈣離子能力和肌質網攝鈣能力下降，影響心肌的正常生理活動.1992年Jiang報道了雌激素能夠抑制豚鼠心肌的L型鈣通道，后來人們相繼運用不同的實驗方法得到了相似的結果.2001年高瞻的實驗結果也證明雌激素能降低收縮心肌細胞的鈣瞬變，并且具有劑量依賴性.進一步的研究證明，雌激素通過抑制鈣超載對心肌細胞有保護作用.本實驗中，缺氧／復氧時間與細胞內鈣離子濃度呈正相關.雌激素處理后細胞內鈣離子濃度、鈣瞬變幅值和半高寬均小于缺氧／復氧損傷組，因此，雌激素能夠參與鈣離子活動的有序調控.這可能是雌激素對心肌保護作用的機制之一.

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［5］SANG HUI CHU，PAUL GOLDSPINK，JILL KOWALSKI，et al.Effect of estrogen on calcium－handling proteins，β－adrenergic receptors and function in rat heart［J］.Life Sciences，2006，79：1257－1267.

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Effect of rstrogen on calcium concentration in myocardial cells suffering from Hypoxia／Reoxygenation

ZHONG Shi－gang，ZHAO Yue－liu，HUO Hong－liang

（School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China）

Estrogen can protect myocardial cells from Hypoxia／Reoxygenation injury，but the mechanism is not fully understood.Hypoxia／Reoxygenation can causes myocardial cells injury，in which the occurrence of calcium overload is an important factor.The aim of this study is mainly to investigate the effect of estrogen on calcium concentration in myocardial cells suffering from Hypoxia／Reoxygenation.Results shows that：after Hypoxia／Reoxygenation，the Calcium concentration in myocardial cells increased significantly，and in a Reoxygenation time－dependent manner.Estrogen can inhibit this increase induced by Hypoxia／Reoxygenation，and effectively prevent calcium overload in myocardial cells.

estrogen；Hypoxia／Reoxygenation；calcium overload

Q 463

180·2417

A

1000－1832（2011）04－0118－04

2011－06－23

吉林省科技發展計劃項目（200905103）.

鐘世剛（1982—），男，碩士研究生；通訊作者：霍洪亮（1963—）男，博士，副教授，主要從事心血管炎性機制研究.

方 林）