揭秘化妝品安全性評價技術(二)

　　自從人們開始生產和使用化妝品以來，一直就有接觸化妝品產生不良反應的報告。隨著科學知識的不斷增長以及公眾對化學物質潛在危害的逐步認識和關心，一些國家制定了目的在于管制化學物質使用的法規，并建立了一套評價化學物質對人類不良反應的試驗方法。因為從倫理上講，既不能用人類做實驗，又沒有其它更好的方法，因而一直以來都理所當然采用動物實驗進行毒理學安全性評價，以此類推對人體健康的危害。但是隨著科學技術的進步，人們對待動物態度的變化和動物福利意識的高漲，科學研究中某些動物試驗的方法也在適應這一趨勢而發生變革。
　　
　　一　什么是3R
　　
　　實驗動物作為人類的替身為人類的科學發展起到了不可替代的作用，隨著科技的發展，生命科學研究領域實驗動物使用數量猛增，實驗動物的痛苦及其權利引起了社會公眾的極大關注，特別是在西方動物保護運動的推動下。1959年拉舍爾和微生物學家伯可(Burch)在其著作《人道實驗技術原理》(Principles of HumaneExperimental Technique)一書中第一次系統提出了3R(reduce，refine，replace)理論。之后，歐美各國成立了許多科學研究用動物福利的保護組織，如成立于1969年的英國醫學試驗用動物中替代法基金會(FRAME)和國際動物福利基金會(IFAW)，1980年成立的人道對待動物協會(PETA)，1981年約翰霍普金斯大學動物試驗替代中心(CAAT)成立，這些基金會或研究機構的成立，推動了實驗動物福利立法的進程，也促進新的科學研究方法的快速發展。
　　3R理論自形成以來一直影響著西方發達國家有關實驗動物的法規，如美國的動物福利法案(1966年)，瑞士的動物福利法(1979年)。進入20世紀80年代后，歐美等發達國家動物福利法的發展進入快速發展的軌道，如英國的動物科學實驗程序法案(1986年)，瑞典1988年公布實施了《動物福利法》(2002年修訂)，丹麥1991年實施了《動物福利法》，1993年德國實施了《動物福利法》(1998年修訂)，葡萄牙1995年公布實施了《保護動物法》，日本《人道對待和管理動物法》(2005年)。總的來說，歐洲大多數國家的動物福利保護立法是比較完備的，在世界上具有重要的影響。我國1988年發布了《實驗動物管理條例》，科技部2006年發布了《關于善待實驗動物的指導性意見》，在規范我國實驗動物管理的同時，也順應了國際對動物福利的要求，但我國還沒有制定專門的動物福利法。
　　
　　二　3R的含義
　　
　　3R中減少的含義是指在科學研究中，使用較少的動物獲取同樣多的試驗數據或使用一定數量的動物能獲得更多試驗數據的方法。如果某一研究方案中必須使用實驗動物，同時又沒有可靠替代方法選擇，則應考慮把使用動物的數量降低到實現科研目的所必需的最小量。優化是指通過改善動物設施、飼養管理和實驗條件，精心設計技術路線和實驗手段，精煉實驗操作技術，盡量減少實驗過程對動物機體的損傷、減輕動物遭受的痛苦和應激反應，使動物實驗得出科學的結果。優化的內容是比較廣泛的，簡單概括就是實驗設計科學化、動物試驗規范化和標準化的過程。替代是指一項試驗方法能減少動物使用數量，或能優化試驗程序以減輕動物痛苦或增加動物福利；或者能用非動物系統或者系統發生學上比較低等的動物種類代替高等級動物進行實驗，如用無脊椎動物代替哺乳類動物。根據是否使用動物或動物組織，替代可分為“相對替代”和“絕對替代”，前者指使用脊椎動物細胞、組織及器官進行體外試驗，或用低等動物替代高等動物的試驗，而后者則是完全不使用動物，如采用培養的細胞或組織、計算機模型等。根據替代的程度，替代可分為“部分替代”和“完全替代”，前者指利用其他實驗手段代替動物實驗中的某一部分，后者指用新的非動物實驗方法取代原來的動物實驗方法。
　　對于化妝品安全評價中替代方法，可以選擇體外培養物(細胞、組織或器官的培養物)代替實驗動物、低等動物代替高等動物、人群研究資料、數學和計算機模型的應用，以及物理和化學技術的應用(如皮膚功能的測定)。可以說開發新的體外試驗方法，減少、優化和替代動物實驗既是保護動物權益的需要，也是科技進步和社會經濟發展的需要。
　　
　　三　歐盟化妝品安全性評價動物福利的背景
　　
　　歐盟有關動物實驗的法規體系由區域層次和國內層次兩個體系組成，既有歐盟及其大多數成員國參加的歐洲條約，又有歐盟各國各自動物保護的法律規定，還有由政府部門和行業協會發布的管理規定和標準。
　　1986年3月18日，在法國的斯特拉斯堡通過了《用于實驗和其他科學目的的脊椎動物保護歐洲公約》(European Conventionfor the Protection of VertebrateAnimals used for Experimental andother Scientific Purposes，CETSno.123)，該公約于1991年1月1日生效。公約旨在減少各成員國實驗的次數以及使用動物的數量，鼓勵成員國積極開展動物替代方法的研究，并僅在沒有動物替代方法的情況下才用動物做實驗。實驗動物的選取應遵從明確的定量準則，并應得到良好的照顧，盡可能免受可避免的痛苦。
　　為了落實歐洲公約的要求，協調各成員國的國內立法，消除貿易壁壘，防止競爭出現扭曲，避免影響共同市場的建立和功能，歐洲共同體于1986年11月24日在布魯塞爾頒布了《關于使各成員國有關用于實驗和其他科學目的動物的保護法律、法規和行政規章接近的理事會指令》(即指令86／609／EEC)。指令正文和附件的規定與公約的規定基本一致。指令實施24年來，已成為歐盟范圍內從事科學研究、檢驗用動物普遍遵守的準則。最新的報道指出，為了適應歐盟范圍擴大和新的形勢發展，如何使歐盟新成員國在實驗動物福利方面協調一致成為立法者考慮的問題，2008年，歐洲委員會決定重新修訂86／609／EEC指令。2010年9月8日，歐洲議會表決通過了新指令2010／63／EU，取代已實施25年了舊指令，成為保護實驗用動物共同遵守的法律在歐盟27個成員國中得到實施，以規范每年在歐洲實驗室超過1200萬只動物的使用。BBC認為，隨著2009年12月歐盟里斯本條約的推出，動物福利與反歧視、推動性別平等、保護人類健康和維護人類福利，共同成為歐盟的4個核心價值。新法規修訂體現了以“3R”為中心的原則，具體涉及動物試驗的倫理評估和建立持續的倫理審核制度，非人靈長類動物的使用，加強法規的透明度和執行力，加強成員國之間動物倫理的合作等內容。新條款中也提到了相關的宗教規則，傳統習俗和民族傳統應該受到尊重。根據程序，各成員國轉換為國內法的立法限期為2012年11月，各成員國法律條款的實施期限為2013年1月1日。
　　
　　四　歐重化妝品安全性評價動物福利的要求
　　
　　歐洲是唯一有法規禁止使用動物實驗進行化妝品安全性評價的地區。眾所周知，歐洲化妝品管理的法規是76／768／EC。1986年歐洲保護試驗用動物的歐洲公約和理事會指令發布后，迫使藥品、生物制品、化學品等與安全評價相關的行業執行這一共同的法律規定，化妝品行業也不例外，研發新的體外試驗方法成為化妝品行業的一項重要任務。歐盟成員國先后成立了專門的研究機構，1989年，德國成為首個建立國家替代方法研究驗證中心的國家。1990年歐盟在意大利成立了歐洲替代方法驗證中心(ECVAM)，專門從事替代方法的驗證和法規認可工作。歐洲化妝品、盟洗用品和香水協會(COLIPA)建立了動物實驗替代方法委員會(SCAAT)，以執行法律的規定和保障化妝品工業的發展，接受應用非動物的替代方法進行化妝品安全性評價。各大公司投入巨額經費從事替代方法的研究。歐洲框架計劃也投入巨額研發經費資助非動物試驗方法的研發，一大批新的化妝品毒理學安全性評價的體外試驗方法被提出，進入科學驗證程序和被法規接受。科學家和管理者逐步認同不再信賴于動物實驗的新的毒理學試驗體系。
　　在技術進步的推動下，2003年，歐委會通過了關于76／768／EEC的第七次修訂，即2003／15／EC指令，該指令明確了取消動物實驗的時間表。指令明確規定自2009年3月11日起，禁止使用動物進行化妝品急性毒性、眼刺激和過敏試驗，2013年將全面禁止在動物身上進行化妝品和原料的安全性測試，也不允許成員國從外國進口和銷售違反上述禁令的化妝品。該規定對歐盟內部成員國和非歐盟國家進口的產品的要求是一致的。
　　這一指令的出臺，可以說是在歐洲范圍內，將動物福利和3R的原則從最初的理念(1959年)，到立法約束(1986年)、再到技術進步(2003年)，再到最后形成法律禁令(2009年)，穩步推進分步實施。客觀上形成了技術壁壘，影響到化妝品的進出口貿易。為了進一步明確2003／15／EC指令的要求和提高可操作性，2006年6月7日歐盟委員會頒布了《依照76／768／EEC沒有使用動物實驗的聲明指引》(即2006／406／EC)。指引規定，對不使用動物試驗的化妝品，其產品制造商或負責產品投放市場信息的個人(代理商)，可以聲明其產品沒有經過動物試驗。發布這一聲明不是強制性的。對于“非動物試驗”的標簽聲明的使用不能誤導消費者，消費者能從知情的選擇中獲得真實的利益。該聲明的使用不應導致以該類聲明作為市場手段的生產商和(或)供應商之間不公平的市場競爭。
　　2009年12月，歐盟發布了新的化妝品法規1223／2009／EC，在過度期后將取代指令76／768／EC成為歐洲的化妝品統一法律。該法律保留了原指令對動物試驗禁令的規定，進一步明確3R的原則，列為第五章第18條，同時對禁止動物試驗的情形和豁免條件作出了規定。
　　
　　五　美國化妝品法規對動物福利的要求
　　
　　1976年和1980年，在美國動物福利協會(AWI)、動物聯合行動組織(UAA)和動物保護協會的共同努力下，《動物福利法》(制定于1966年)和《人道主義飼養和使用實驗動物的公共衛生方針》重新修訂。通過這兩個法規性文件，使3R在動物實驗方面的應用得以落實。另外，修訂的《動物福利法》還規定了減少動物痛苦的標準，并要求研究者在可能引起實驗動物痛苦時考慮替代方法。1981年，CAAT成立，1986年美國國會提出了關于在研究、檢驗和教育中動物應用替代物的技術評估報告。1993年CAAT作為東道主舉辦了第一屆生命科學中替代物和動物應用世界大會。在美國，許多國家部門的工作中滲透了動物替代實驗的原則。1993年，一個由多部門參與的組織，替代方法驗證跨部門協調委員會(ICCVAM)成立。ICCVAM由15個聯邦管理和科研機構組成，包括消費者產品安全委員會、農業部、國防部、能源部、內政部、交通部、環保局、食品藥品管理局、國立癌癥研究所、國立環境衛生科學研究所等聯邦機構。其主要職責是技術協調和評估新的和修訂的實驗方法。到目前為止，經ICCVAM評估驗證的體外方法涉及許多安全評價終點，包括急性經口毒性、發育毒性、內分泌紊亂、眼腐蝕／刺激、遺傳毒性、熱原試驗、皮膚腐蝕和皮膚敏感性。
　　在化妝品行業，20世紀70年代美國動物保護主義者抗議使用動物進行試驗，強烈抨擊化妝品毒性鑒定中的眼刺激試驗和急性毒性試驗使動物遭受痛苦、損傷甚至不正常死亡。世界知名的Revion化妝品公司被迫與動物保護者談判，同意提供250萬美元資助洛克菲大學研究Draize眼刺激試驗的替代方法。1980年，美國化妝品、盟洗用品和香水協會(CTFA)共同贊助成立了CAAT專門致力于替代方法的研究。1993年，美國的“動物權利法”強制研究單位建立“倫理考察委員會”，鼓勵化妝品公司和研究單位開展動物替代方法和優化試驗程序的研究，同年美國國會成立了ICCVAM和機構間替代方法管理小組(IRAG)，后者由美國FDA、環境保護局(EPA)和消費品安全委員會(CPSC)為代表，早期開展了一個三年研究計劃(1991－1994)，從41個實驗室29個不同試驗方法得到的60個實驗數據評價眼刺激替代試驗方法的有效性。進入21世紀，美國替代方法的研究、驗證以及認可進程明顯加快。
　　
　　六　國際社會對動物試驗替代技術的認可
　　
　　2002年，OECD正式成立了動物保護國際委員會(ICAPO)，許多非政府組織、企業界和環保界的代表共同參與。歐洲、美國和日本等主要國家統一在OECD的框架內發揮各自作用，在化學測試指南中倡導有關實驗動物保護的建議。ICAPO成立以來，替代方法的驗證和認可明顯加快，從2002年起已有10多項替代方法被認可，2009年新發布的健康和環境評估的替代／優化方法多達9項，2010年重新發布和修訂的方法超過6項。在方法驗證和認可方面，上世紀90年代初，國際社會對于替代方法的驗證還存在爭論，雖然當時OECD內部沒有成立專門的替代驗證機構，但在積極協調成員國的立場和推動全球范圍內的替代方法認可方面做了大量工作。2005年，OECD制訂了替代的驗證和認可指南，2004年和2007年，OECD還分別提出了(Q)SAR模型的驗證指南。2007年在加拿大召開了由歐洲、美國和日本參加的化妝品法規國際協調會議(International Cooperationon Cosmetic Regulation，ICCR)，推動替代方法的國際合作和促進3R的發展。
　　到目前為止，化妝品安全評價方面，通過有效性驗證的動物替代方法有急性毒性試驗、皮膚腐蝕性／刺激性試驗、眼刺激性／腐蝕性試驗、皮膚光毒性試驗、皮膚光敏感性試驗、皮膚滲透試驗和生殖毒性試驗，有的方法并已收入OECD化學物質試驗指南中。
　　縱觀3R理念提出50年來在化妝品毒理學領域中動物試驗替代方法的發展軌跡，大致可分為三個階段。1986年以前是立法接受的階段，歐洲公約的發布使包括化妝品在內的各行業在科學研究的動物試驗中執行動物福利的原則提高到了法律的層次，從此，歐洲的替代方法研究從民間的自發行為，正式成為政府工作職責的一部分。1986年到2009年是科技進步推動3R原理從理念到現實的階段，許多現代科技手段在毒理學評價試驗中得到應用，如細胞培養、組織工程技術、基因組學、高通量篩查技術和計算機模型，帶來了檢驗標準的更新和法規管理的變革。2009年以后，(至少在歐盟范圍內)化妝品動物試驗禁令正式生效，它給歐盟以外的其它國家帶來的不僅是化妝品貿易受阻和檢驗技術壁壘，更多的是適應這一壁壘的技術進步和觀念更新。只有順應這一趨勢，提高化妝品安全評價技術的現代化水平，才能保障我國化妝品進出口貿易和安全檢測技術的健康發