園林植物組織培養(yǎng)過程中褐化問題的研究

摘 要:綜述了園林植物組織培養(yǎng)過程中褐變發(fā)生的機(jī)理、影響褐化的因素及控制褐化的方法等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞:園林植物 組織培養(yǎng) 褐化 褐化控制

中圖分類號:TU986文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1674-098X(2011)04(a)-0126-02

在園林植物組織培養(yǎng)過程中褐化現(xiàn)象是普遍存在的，它與菌類污染、過度含水化(即玻璃化)并稱為植物組織培養(yǎng)的三大難題，而控制褐化比控制污染和玻璃化更加困難。因此褐化能否得到有效的控制是對某些植物的組織培養(yǎng)能否取得成功起到?jīng)Q定性的作用。在組織培養(yǎng)過程中存在褐化現(xiàn)象的園林植物主要有:蝴蝶蘭、銀杏、非洲菊、牡丹、芍藥、鳳梨、瑞香、玫瑰、大巖桐、大花茉莉、倒掛金鐘、觀賞羽衣甘藍(lán)、花燭、郁金香、飛燕草、風(fēng)鈴草、紫葉黃櫨、桉樹、東北紅豆杉、巴拉圭冬青、茶樹等。本文就近年來關(guān)于園林植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象的研究進(jìn)展作一綜述。

1 褐化的機(jī)理

在植物組織培養(yǎng)過程中所說的褐化是指外植體在誘導(dǎo)脫分化或再分化過程中，自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，以至培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象。

褐化的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物和多酚氧化酶活性有直接的關(guān)系，很多植物特別是某些木本植物，如棗、銀杏等都有高含量的酚類化合物，這些化合物在完整的組織和細(xì)胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩(wěn)定。當(dāng)外植體組織被切割后接種時，切口附近的細(xì)胞受到傷害， “分隔效應(yīng)”被打破，酚類化合物與多酚氧化酶接觸后經(jīng)其催化迅速氧化成褐色的醌類物質(zhì)和水，醌類物質(zhì)又會在酪氨酸酶等酶的作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，使切面迅速變成棕褐色或暗褐色，這些褐色物質(zhì)會逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，進(jìn)一步引起其他酶系統(tǒng)失活，毒害整個外植體組織，抑制外植體的脫分化、再分化和組培苗的正常生長。

2 影響褐化的因素

2.1 不同外植體對褐化的影響

2.1.1 材料的年齡和大小

褐化隨材料的年齡和組織木質(zhì)化的程度而增加，Chever分析歐洲栗的酚含量變化的結(jié)果表明，幼嫩材料酚類化合物含量少，而成齡材料比較多。

外植體大小對褐化的影響，表現(xiàn)為小的材料更容易發(fā)生褐化，相對較大的材料則褐化的程度較輕。何康等(2005年)也指出，在南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)中，嫩葉切塊小于1cm×1cm時，葉塊易褐變死亡。另外切口越大，酚類物質(zhì)的被氧化面也越大，褐化程度就會更嚴(yán)重。

2.1.2 取材的時間

何松林(2005年)等在牡丹葉柄離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，冬春季取材褐化死亡最低，夏季時取材容易被氧化褐化。這是由于植物體內(nèi)酚類化合物含量和多酚氧化酶的活性在不同的生長季節(jié)并不相同，一般在生長季節(jié)含有較多的酚類化合物?？ǖ绿m、棗也有類似的情況。

2.1.3 取材的部位

張明麗等(2005年)在金葉紅瑞木離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，生長期取嫩枝段作外植體時， 枝條上部頂生枝段的褐化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于下部腋芽莖段，褐化率高達(dá)62.7%，而下部莖段的褐化率只有4.3%。隨著芽位的降低，褐變率顯著增加。

2.2 培養(yǎng)基對褐化的影響

培養(yǎng)基的狀態(tài)影響褐變的程度。許多實驗表明，液體培養(yǎng)基可減輕外植體的褐化，液體培養(yǎng)基再加上濾紙或棉花做成紙橋效果會更好。鐘紅梅報道鳳梨用液體培養(yǎng)可以減輕褐變。

在初代培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度過高可引起酚類分泌物大量產(chǎn)生，導(dǎo)致外植體褐變，降低無機(jī)鹽濃度可減少酚類物質(zhì)的分泌，從而減輕褐變。葉曉青等在蝴蝶蘭原球莖的增殖培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，1/2MS或改良MS較MS效果好，減少MS中大量元素和部分微量元素及有機(jī)成分有利于原球莖的增殖和分化。

還有報道，高濃度的糖、絲氨酸及硼都可以加劇褐變的發(fā)生，而氨態(tài)氮過高也有類似結(jié)果。此外，培養(yǎng)基的PH值可能對酚類和酚氧化酶結(jié)合部位產(chǎn)生影響。

2.3 生長調(diào)節(jié)劑對褐化的影響

在初代培養(yǎng)中，高濃度的生長調(diào)節(jié)劑嚴(yán)重影響褐變的程度。BA或KT不僅能促進(jìn)酚類化合物的合成，而且刺激多酚氧化酶的活性，增強(qiáng)酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)的能力，從而加劇褐化的程度。

2.4 培養(yǎng)條件及其他因素

光照能促進(jìn)多種植物組織培養(yǎng)中酚的氧化，與酚類物質(zhì)的合成和氧化相關(guān)的酶都是光誘導(dǎo)型，因此將培養(yǎng)物在低光照或置于暗光中培養(yǎng)一段時間能減輕褐變。楊博等(2003年)在玫瑰的初代培養(yǎng)中，對外植體進(jìn)行不同程度的田間遮蔭處理，發(fā)現(xiàn)重度遮蔭可使玫瑰初代培養(yǎng)的褐化指數(shù)降低，萌芽率提高，總酚量降低，證實了光照強(qiáng)度影響總酚的合成。

溫度也對褐化影響很大，高溫能促進(jìn)PPO的活性，促進(jìn)酚類氧化。此外，培養(yǎng)基的放置方式、抗氧化劑的使用以及轉(zhuǎn)瓶周期等都不同程度地影響外植體的褐化程度。

3 控制褐化的方法

3.1 母株和外植體的預(yù)處理

對母株進(jìn)行遮光處理，可以減輕一些品種的褐化程度。楊博和韓振海在玫瑰的初代培養(yǎng)田間遮蔭處理時發(fā)現(xiàn)，重度遮光處理下褐化的百分比最低，，而自然光照和輕度遮光處理下，褐化百分比分別為88.3%和79.6%。切割外植體時在抗氧化劑或吸收劑中進(jìn)行，或用這些藥劑保存剛切下來的組織，由于隔離了切面?zhèn)诘难趸鸵种芇PO的活性等原因，可以減少褐化。在油棕、紅豆杉等組織培養(yǎng)上可采用此法。但對那些組織快速氧化的植物，如蘋果、油橄欖等用抗氧化劑處理則沒效果。預(yù)培養(yǎng)有助于避免酚類物質(zhì)和其它生長抑制物的毒害作用。在20年生的檸檬桉母本植株上采集的莖芽，需先在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d，然后再在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。茶樹帶少量葉的莖段預(yù)培養(yǎng)15d，均有助于減輕褐化。

3.2 培養(yǎng)基中加入防褐劑

許多報道認(rèn)為，在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑可以明顯減少褐變生。劉蘭英在核桃組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中Vc含量為0.5 g/L時，褐變率為68.4%，5.0g/L時則為55.4%。陳學(xué)森等在銀杏組織培養(yǎng)中應(yīng)用植酸作抗氧化劑也取得了一定成效。吳震先等認(rèn)為，SO2可以抑制PPO的活性。

另據(jù)報道，PVP、AC(活性炭)等吸收劑也可以減輕褐變的發(fā)生。如蝴蝶蘭。但也有報道吸收劑有時也有副作用，如AC不僅能吸收有毒的物質(zhì)，同時它還能吸附植物生長所必須的營養(yǎng)元素。

3.3 選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

包括溫度、光照、培養(yǎng)基的PH值和狀態(tài)，激素的種類和濃度，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選用等。李用改良MS或C2d、芍藥使用1/2MS培養(yǎng)基可減輕褐化;在初始培養(yǎng)時把植物的外植體處于不適合酚類合成的條件下，如黑暗或弱光中培養(yǎng)，可抑制酚類的氧化。

加快繼代轉(zhuǎn)瓶的速度，及時更換新鮮培養(yǎng)基，可以減輕酚類物質(zhì)對培養(yǎng)材料的毒害作用。如蘭花、紫葉黃櫨、大花飛燕草、瑞香在莖尖或腋芽培養(yǎng)中使用了這個方法。

4 結(jié)語

存在于園林植物細(xì)胞內(nèi)的酚氧化酶有多種，而目前研究的PPO(多酚氧化酶)，對其它的酚氧化酶在褐變中所起的作用機(jī)理和程度研究較少。

由于不同的植物中酚氧化酶的生化特性有所差異，因此，不同園林植物組織培養(yǎng)中解決或減輕褐變的方法有所不同。

由于不同植物中酚氧化酶的活性不同，所含酚類物質(zhì)的含量和種類不同，不同植物褐變發(fā)生的程度差異較大。

影響褐變的環(huán)境因素除了光照、溫度外，還有O2及其它因素，但在這些方面報道較少。

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