人乳頭瘤病毒疫苗的研究及應用前景

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2011.36.009

生殖道人乳頭瘤病毒(HPV)感染生殖道，是生殖道腫瘤高危因素之一，尤其是宮頸癌，HPV感染是95%宮頸癌的原發因素。因此，HPV的相關研究為婦科腫瘤醫生所重視，綜述HPV疫苗的研究方法及現狀。

HPV的流行病學、分子生物學及免疫學基礎

生殖道HPV感染廣泛分布于世界各地，是最常見的病毒性性傳播疾病。迄今為止，HPV有100多種亞型，其中25種易感陰道，在研究中常將其分為高危型和低危型。低危型包括6、11、34、40、42、43、44等，通常不進展為惡性病變。而前者則不然，多與高度宮頸病變和宮頸癌有關，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、54、56、58、59、66、ME180等。75%以上的宮頸癌中發現的是l6、l8、3l和45型，其中l6型與鱗癌有關，而l8型與腺癌有關［1］，宮頸癌中90%是鱗癌，因此對16型的研究較多。對HPV流行病學的研究已經深入到各個年齡階段的人群，包括老年人和兒童［2］，HPV疫苗因此逐步受到重視。

HPV屬于乳頭多瘤空泡病毒科乳頭瘤病毒屬，是由DNA核心和蛋白衣殼組成的無包膜DNA病毒，衣殼由主要(L1)和次要(L2)衣殼蛋白組成，HPV具有明顯的種屬特異性，它們不能在動物體內感染，也不能作體外細胞培養。不同型別的HPV基因結構基本相似，是雙股環狀DNA，由3個基因區組成，按其功能可分為早期區(E區)、晚期區(L區)和上游調節區(URR)。早期區含有6個開放閱讀框(ORF)，其中E6、E7主要與病毒細胞轉化功能及致癌性有關。E6不僅通過結合并降解p53從而導致細胞周期失控，而且能激活端粒酶使正常細胞永生化，E7則通過與控制細胞周期有關的腫瘤抑制蛋白Rb的相互作用，使細胞周期失控而發生永生化，兩種原癌蛋白的表達是維持腫瘤細胞處于轉化狀態所必須的，其中E7原癌蛋白是HPV的主要轉化蛋白［3］，因此，將E6、E7，原癌蛋白，尤其是E7視為腫瘤特異性抗原，是研究開發疫苗的主要著眼點之一。

預防性疫苗

作用機制：目前HPV預防性疫苗種類較少，是一種亞單位疫苗。現有疫苗是由病毒衣殼蛋白L1或L1與L2組成，在細胞內可自我組裝成病毒樣顆粒(VLPs)。VLPs具有與完整病毒相同的抗原空間表位，可激發機體的CD4+T細胞介導的體液免疫應答，刺激機體產生高效價保護性中和抗體，從而保護疫苗接受者不被疫苗所代表的類型的HPV病毒感染。因此，VLPs是一種合理的預防性疫苗。由于VLPs只含病毒抗原，不含病毒DNA，具有免疫原性的同時，不會導致病毒感染或誘發癌癥，使用安全。目前已被美國FDA認證上市的只有兩種預防性疫苗。即Gardasil疫苗為四價的包含HPV16、18、11、6的VLPs，單一鋁鹽為佐劑；兩價的Cervarix疫苗的HPV為包含HPV16和HPV18的VLPs雙價疫苗［4］。

臨床應用及臨床效應的評價：HPV預防性疫苗用于預防由HPV6、11、16、18型感染所引起的癌癥、癌前病變、不典型病變、生殖器疣以及感染。目前全球范圍內批準使用的人群為9～45歲女性以及9～26歲男性。上述兩種疫苗至今已分別在其觀察期內(Gardasil 64年、Cervarix 5年)見到其保護效力持續存在。2009年WHO發布了第一份關于HPV疫苗的立場文件，對Gardasil給予質量預認證，以及批準Cervarix進入發展中國家。已在接種過四價疫苗的15～26歲女性和接種過二價疫苗的15～25歲女性中開展過多中心、隨機、雙盲、以CIN Ⅱ、Ⅲ和(或)AIS作為終點的II期和III期試驗四價疫苗獨有的終點是外陰上皮內瘤變(VIN)或陰道內瘤變(VAIN)和生殖器疣［5，6］。Gardasil已在117個國家或地區被批準使用，全球33個國家多中心的聯合試驗結果表明，疫苗對宮頸癌、癌前病變以及其他生殖道疾病的預防作用可達99%～100%。Cervarix已經在全球100個國家獲得批準使用。一項Ⅲ期研究對HPV二價疫苗預防疫苗相關HPV基因型所致CIN Ⅱ、Ⅲ的效力進行了評估。該研究共納入了18644名15～25歲女性，經過平均148個月的隨訪后發現，疫苗預防HPV16型或18型所致CIN 2、3的效力90%，納入研究的女性至少接種過1針次，且在基線時尚未暴露于16或18型。在一項擴展性II期研究中，對776名15～25歲女性進行了為期64年的隨訪，對于至少接種過一針次且在基線未暴露于相關HPV基因型的女性，該二價疫苗對HPV16和HPV18所致CIN Ⅱ、Ⅲ的保護效力達到100%。

安全性評價：9～45歲人群接種四價疫苗普遍良好耐受；最常見的不良事件為接種部位局部反應；發生率＞1%，未出現因疫苗相關的嚴重不良事件引致的接種中止；目前，大規模的上市后安全性監測正在進行中，不建議給妊娠婦女接種疫苗，但這兩種疫苗均為顯示與妊娠及其胎兒的不良后果因果相關。

治療性疫苗

重組蛋白疫苗：重組疫苗往往在一次接種之后即可高效誘導體液和細胞免疫反應。以病毒或細菌作為載體，構建E6、E原癌蛋白重組疫苗都能誘導特異性CTL，抑制HPV相關腫瘤的發生。Chen等首先證實，HPV16 E免疫動物可獲得特異性CD8陽性淋巴細胞介導的腫瘤排斥反應。但是活病毒疫苗的缺陷在于存在安全性問題，尤其是E6/E7，兩者均為腫瘤轉化蛋白，為此有學者運用點突變技術，改變個別核苷酸，以降低其轉化效率，亦有學者尋找新的靶抗原蛋白，如L1蛋白無論是作為融合蛋白，還是由疫苗病毒重組體或是質粒DNA中表達，或是重組人不含病毒基因組的病毒樣顆粒(VLPs)均有保護作用，但這種保護作用需要全長的蛋白或是完整的VLPs，是否能夠誘導型別特異性免疫反應也有待進一步研究，上述觀點均是以后研究可能的發展方向。減毒細菌活疫苗的優點在于對人體的安全性，是抗原決定簇的良好載體，既可注射又可口服，口服或局部用藥后還能產生黏膜免疫。Bermudez Humaran等［7］，通過乳酸乳球菌生產HPV16 E7蛋白。此方法可得到更高量的蛋白，不失為口服疫苗新的候選方案，但是HPV的多型性仍是疫苗制備的一個難點。

合成多肽疫苗：T細胞識別抗原是抗原遞呈細胞(APC)MHC分子遞呈的8～10個氨基酸組成的多肽，理論上可以通過人工合成T細胞的表位，輔以適當的佐劑，使之能與MHC分子結合，從而激發人體免疫反應，因此，合成多肽疫苗安全，容易儲存和處理，有理想的靶特異性。由于宮頸癌多數表達 蛋白，因此，針對該抗原的細胞免疫反應顯得很重要。另一方面，抗原識別的特異性、復雜性以及反復使用產生的中和抗體等，在一定程度上也限制了多肽疫苗的發展。Zwaveling等證實HPV16 E7的35個氨基酸的長多肽E7(43～77)包含有CTL和Th細胞的表位，與只有CTL表位的多肽相比，前者能更好地誘導E7特異性的CD8陽性T細胞的反應，此效應涉及兩種不同的機制，一方面它可誘導特異性的CD4陽性Th細胞的產生，而CTL產生的水平依賴于Th細胞與特定APC的相互作用；另一方面，帶有長多肽和DC細胞激活因子的疫苗可以大量地誘導CTL的產生，即使是在沒有Th細胞的情況下。與DC細胞刺激因子CpG混合的長多肽疫苗可使已建立的腫瘤消失。Liu等構建一種新型的疫苗E7蛋白CTL表位44～62和熱休克蛋白(Hsp70)的融合多肽疫苗［8］，使用rAAV作為載體，動物實驗中顯示出良好的腫瘤保護作用，轉染效率高，且使用rAAV可使作用延至l5年，避免反復使用及由此產生的中和抗體。因此認為，rAAV載體具有安全、高效的優點，rAAV-E7CTLHssp疫苗在宮頸癌的治療中前景可觀。

核酸疫苗：由于核酸疫苗可同時激活細胞和體液免疫，且可制備成高效、多價疫苗，制備提純簡便等受到重視，其中針對E蛋白的DNA疫苗占主要地位。但是，體內動物實驗證實，對于單純的E7疫苗，抗原的遞呈并不令人滿意。Wolkers等通過動物實驗證實［9］，表位指向的DNA疫苗可以提高效率，95%以上的動物可誘導出高效的CD8陽性T細胞反應。

外源HPV DNA可能整合入宿主基因組DNA，使宿主細胞進而轉化成癌細胞，安全性成為阻礙其發展的第一要素。Smahel等使用修飾了的HPV16 E7基因DNA疫苗進行體外實驗［10］，在E7基因Rb結合點加入3個突變位點GGG，實驗對比4種疫苗的作用：E7、ETGGG及2種融合基因L16c E(1瑚)、Sig/EAMP-I。結果顯示，E GGG免疫原性明顯優于E7和LISC E7(1～60)，與g/ET/LAMP-1相似，合用不能提高免疫原性。修飾的DNA疫苗不僅去除了癌基因的結合位點，而且并不影響其免疫原性，實驗中引入的基因槍介導的皮內注射優于肌肉注射。

另外，自身復制的RNA疫苗(RNA復制子)也是目前腫瘤免疫治療中引人注意的方法之一。RNA復制子并不整合入宿主DNA，消除了DNA疫苗的潛在致瘤性。Cheng等在動物實驗中使用辛德畢斯病毒自身復制RNA載體(SIN-rep5)［11］，并比較針對不同定位靶E7蛋白的疫苗效果，核E7蛋白、分泌的E7蛋白(Sig/E7)、定位于溶酶體的溶酶體相關膜蛋白1和E7蛋白的聯合體(LAMP-I/ET)。結果顯示，三者均有很強的抗腫瘤作用，尤其是LAMP-I/E，LAMP-I可增強RNA疫苗的使用潛能，機制涉及CIM陽性和CD8陽性T細胞以及NK細胞。

討 論

宮頸癌作為一種感染性疾病，其預防性疫苗在疾病預防中的作用是不言而喻的。由于HPV治療性疫苗采用了致癌基因，因而歐美有關方面對于HPV治療性疫苗的臨床試驗非常謹慎，治療性疫苗至今沒有面市。另一方面，由于HPV的衣殼蛋白(L1)不具有致癌性，同時，可以產生高滴度的中和抗體，能夠有效地保護相應的HPV型別的感染，因而，HPV預防性疫苗得到國際上的廣泛承認和應用。眾所周知，已經商業化的HPV預防性疫苗針對宮頸癌只能保護HPV16和18兩型的感染，如果前述得到的HPV型別分布規律準確的話，商業化的預防性疫苗對我國女性的保護作用有限，尤其是HPV18疫苗在我國是否具有較好人群覆蓋率，是一個值得我們關注的問題。各種疫苗都有其特點和優點，減毒、安全、高效的疫苗前景可觀。因此，減毒的活疫苗、修飾的DNA、聯合疫苗及VLP疫苗將一直是研究熱點。尤其是VLP疫苗，為目前最有前途的預防性疫苗［12］。

參考文獻

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12廖秦平.要真正理解和重視人乳頭瘤病毒感染.中國實用婦科與產科雜志，2010，5:322.