123I的制備及其標(biāo)記新型小分子融合肽的初步研究

楊遠(yuǎn)友，劉 寧，范成中，廖家莉，許發(fā)倫，石福坤，蘭 棟，唐 軍

1.四川大學(xué) 原子核科學(xué)技術(shù)研究所 輻射物理及技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064;2.四川大學(xué) 華西醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610041;3.四川大學(xué) 物理學(xué)院，四川 成都 610064

123I是加速器生產(chǎn)核素，其半衰期為13.2 h，通過電子俘獲發(fā)射159 keV的光子，比活度高(7.10×1016Bq/g)，對(duì)病人的輻射劑量低，在同樣活度下對(duì)甲狀腺的劑量只有131I的1/100左右，可在短期內(nèi)重復(fù)檢測(cè)，探測(cè)效率高，成像清晰，被認(rèn)為是最適合作體內(nèi)診斷的放射性核素之一[1-2]。

單克隆抗體介導(dǎo)的靶向顯像與靶向治療是對(duì)腫瘤以及血栓栓塞性疾病等診斷與治療的有效手段之一。由于完整單抗分子量大，穿透力差，在靶組織中濃集需較長(zhǎng)時(shí)間且分布不均勻，清除慢；為得到穿透力強(qiáng)的小分子片段，采用DNA重組技術(shù)，將編碼特異抗體輕鏈可變區(qū)基因序列和重鏈可變區(qū)基因序列，用特別設(shè)計(jì)的寡核苷酸連接，可得到2～35 kDa的肽段，重鏈可變區(qū)的羧基端通過一條12～20殘基的肽與輕鏈氨基端相連接，其特異性和親和力與親本抗體相同。小分子融合肽擬似物VHCDR1-VHFR2-VLCDR3為經(jīng)過DNA重組技術(shù)得到的分子量約為3 kDa的抗體片段[3]。近期進(jìn)行了131I標(biāo)記VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的研究，其標(biāo)記物對(duì)腫瘤組織已顯示出良好的特異性和親和力[4]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)擬用核性質(zhì)優(yōu)于131I的123I標(biāo)記小分子融合肽擬似物VHCDR1-VHFR2-VLCDR3，以期得到具有良好靶向性的放射性顯像藥物123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3。

基于上述設(shè)想，本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行了123I的生產(chǎn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行小分子融合肽擬似物的123I標(biāo)記，并對(duì)標(biāo)記物在正常小鼠的體內(nèi)分布進(jìn)行初步研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

CS-30回旋加速器，美國(guó)TCC公司生產(chǎn)；溴代琥珀酰亞胺(NBS，純度大于98%)，美國(guó)Acros公司；硅膠(silica gel，0.125～0.178 mm)、TLC硅膠板(20 cm×20 cm)，美國(guó)Aldrich公司；凝膠Sephadex G10，瑞典Pharmacia公司；BS210S電子天平，感量0.001 g，德國(guó)Sartorius公司；甘氨酸(glysine)，美國(guó)Sigma公司；FH-603井型閃爍探頭、FH463A自動(dòng)定標(biāo)器，北京核儀器廠；VHCDR1-VHFR2-VLCDR3，小分子融合肽，相對(duì)分子質(zhì)量約為3 kDa，本課題組自制；石英蒸餾器，本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)加工；Sb2O3，純度99.99%，天津化學(xué)試劑一廠；KOH、檸檬酸，成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品；其它試劑為市售分析純；蒸餾水為三蒸水。

昆明系小鼠，(20±2)g，雌雄各半，購(gòu)于四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1123I的制備123I的制備方法主要有兩大類：第一類是用帶電粒子核反應(yīng)先產(chǎn)生123Xe，然后由其衰變?yōu)?23I[5-6]；第二類是用帶電粒子轟擊碲靶或銻靶直接產(chǎn)生123I[7-11]。考慮本實(shí)驗(yàn)室條件(CS-30加速器)及研制成本，決定采用天然豐度的銻作為靶材料，利用121Sb(α,2n)123I核反應(yīng)制備醫(yī)用123I。根據(jù)Sb(α,xn)反應(yīng)(表1)和激發(fā)曲線，122I半衰期較短，126I和125I的產(chǎn)額較低，主要副反應(yīng)為124I，選擇適當(dāng)能區(qū)以及選擇適當(dāng)靶厚，可以控制124I的產(chǎn)額[12-13]，得到核純度比較好的醫(yī)用123I。試驗(yàn)中采用靶厚度為61～67 mg/cm2的薄靶，如靶厚大于144 mg/cm2，則有可能發(fā)生大量的(α,n)反應(yīng)，從而生產(chǎn)大量雜質(zhì)124I和126I。雖然這種方法會(huì)損失一定產(chǎn)額，但是可以生產(chǎn)出純度好的醫(yī)用123I。本實(shí)驗(yàn)α粒子的能量控制在26.5 MeV左右。

表1 天然Sb靶制備123I的反應(yīng)及其副反應(yīng)[10]

1)Sb2O3電鍍液的配制

將10 g Sb2O3、35 g KOH以及182.5 g檸檬酸溶入500 mL水中，在加熱煮沸的條件下攪拌數(shù)分鐘，得到Sb2O3電鍍液。

2)Sb電鍍條件

將電鍍裝置電壓調(diào)至6 V、電流調(diào)至85 mA、陰極和陽極間距調(diào)至3 cm左右。在上述條件下電鍍14～15 h便可得到61～67 mg/cm2的均勻薄靶，沖洗晾干備用。

3)Sb靶的輻照

將制備好的銻靶在四川大學(xué)CS-30回旋加速器上，通過121Sb(α,2n)123I核反應(yīng)，照射2～3 h，入射的α粒子束流強(qiáng)度在15 μA左右，能量為26.5 MeV左右，將束流以小角度入射到靶上，即采用所謂“傾斜靶”(如束流對(duì)靶子的入射角度為6度，其照射面積就增加了10倍，受照熱功率是垂直照射靶的1/10，而且散熱面積也增加了10倍)，并用水對(duì)靶進(jìn)行冷卻。輻照結(jié)束后將靶子放置冷卻2 h左右，讓短壽命雜質(zhì)核素衰變。

4)輻照Sb靶的干蒸餾分離及Na123I的獲取

“冷卻”2 h后取出輻照靶片，小心放入石英蒸餾裝置中的石英舟里將石英舟加熱至600～750 ℃，用N2作為載氣，以15～30 cm3/min的流速通過靶片，用硅膠吸附蒸出的123I(硅膠柱用自來水冷卻)，再用活性碳和0.1 mol/L NaOH溶液吸附殘余的123I，尾氣最后排空。硅膠吸附柱用100～300 μL的0.1 mol/L NaOH溶液淋洗，洗脫液即為Na123I溶液。將Na123I溶液進(jìn)行放射化學(xué)純度和γ能譜測(cè)定，以確定123I的放射化學(xué)純度和核純度。Na123I的放射化學(xué)純度測(cè)定采用2010版《藥典》方法[14]，以75%甲醇為展開劑，參照放射化學(xué)純度測(cè)定法(附錄ⅩⅢ一法)進(jìn)行[15]。用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，用0.5 mol/L HCl調(diào)pH=7.0，并用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH=7.0)稀釋配成Na123I注射液。

1.2.2123I標(biāo)記小分子融合肽及其分離 在微型反應(yīng)管中加入100 μL(1.85×107Bq)Na123I、10 μL醋酸、10 μL 10.0 g/L溴代琥珀酰亞胺的生理鹽水溶液和10 μL 1.0 g/L VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的生理鹽水溶液，室溫下反應(yīng)10～30 min。然后加入50 μL 0.5 mol/L glysine終止反應(yīng)。用TLC測(cè)量標(biāo)記率和放化純度(TLC條件：流動(dòng)相V(CHCl3)∶V(CH3OH)=4∶1)。另外，取部分標(biāo)記混合物用Sephadex G10柱(20 cm×10 mm)進(jìn)行標(biāo)記物123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的分離，以0.1 mol/L pH=7.6的磷酸緩沖溶液作淋洗液，收集淋洗液，每管1 mL，測(cè)定每管的放射性，繪出淋洗曲線，用TLC測(cè)量標(biāo)記率和放化純度(TLC條件同前)。

1.2.3123I標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的分布 將40只小鼠(雌雄各半)隨機(jī)分為10組，經(jīng)腹腔注射0.1 mL(30 kBq)未分離標(biāo)記物123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3和分離后的123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3，注射后分別于1、3、6、12、24 h處死小鼠。取血、心臟、肝、脾、腎、肺、胃、小腸、肌肉、甲狀腺(含頸部)等組織器官，稱重并測(cè)其放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算各組織的放射性攝取率。放射性攝取率用0.1 mL相應(yīng)標(biāo)記物的放射性計(jì)數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)，以每克組織攝取放射性占總注射劑量的百分比%ID/g表示(甲狀腺的攝取率以%ID表示)。

2 結(jié)果和討論

表2 輻照銻靶參數(shù)及123I產(chǎn)額

2.1123I的制備

以天然銻作為輻照靶，利用121Sb(α,2n)123I核反應(yīng)制備123I，只要根據(jù)Sb(α,xn)反應(yīng)的激發(fā)曲線選擇適當(dāng)?shù)哪軈^(qū)以及適當(dāng)?shù)陌泻瘢涂梢韵拗?24I、126I等核素的生成，得到純度較高的醫(yī)用123I。實(shí)驗(yàn)中輻照靶參數(shù)及123I產(chǎn)額列于表2。靶的平均厚度為63.2 mg/cm2，最高64.3 mg/cm2，最低62.2 mg/cm2，控制α粒子能量為26.5 MeV、束流強(qiáng)度為15 μA的情況下，123I的平均產(chǎn)額為11.6 TBq/(A·h)。靶厚度對(duì)123I產(chǎn)額有一定影響，但在厚度為62.2～64.3 mg/cm2的情況下無顯著性影響。

經(jīng)測(cè)定，Na123I的Rf值在0.6～0.7左右，其放射化學(xué)純度均高于99.3%。通過γ能譜測(cè)定，主要能區(qū)有：159 keV，123I，約98.6%；603 keV，124I，約1.0%；668 keV，126I，約0.4%。這說明得到了核純度較高的123I。

2.2 小分子融合肽的123I標(biāo)記、分離及其體外穩(wěn)定性

由于識(shí)別EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)表面抗原gp350/220抗原決定簇的單克隆抗體擬似物：VHCDR1-VHFR2-VLCDR3及VHCDR1-VLCDR3-VHFR2(對(duì)照)兩種化合物中均含有多個(gè)酪氨酸基團(tuán)，可用放射性核素123I直接標(biāo)記。標(biāo)記過程簡(jiǎn)單易行，可在短時(shí)間完成(10 min左右)。123I直接標(biāo)記后其放化純度可達(dá)90%～95%(表3)，可不分離直接進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)標(biāo)記混合物還用Sephadex G10凝膠柱進(jìn)行了分離，其淋洗曲線示于圖1。淋洗得到的第1個(gè)放射性峰為標(biāo)記物123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3，經(jīng)TLC分析鑒定，123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的Rf在原點(diǎn)處，與VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的Rf=0一致，而游離123I的Rf=0.57。淋洗液的放化純度達(dá)96.6%，可直接用于體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將未分離標(biāo)記物123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3和分離后的標(biāo)記物進(jìn)行了放化純度、體外穩(wěn)定性的比較(表3)。從表3可以發(fā)現(xiàn)，通過Sephadex G10凝膠柱分離后的123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3，其放化純度高于未分離的123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3。此外，標(biāo)記物(包括分離和未分離的123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3)在室溫下放置48 h后，其放化純度無明顯變化，表明標(biāo)記物在體外是穩(wěn)定的。

表3 123I標(biāo)記VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的放化純度變化

圖1 123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3經(jīng)Sephadex G10的淋洗曲線

2.3123I標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的分布

對(duì)分離后的123I標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的分布進(jìn)行了初步探討，并與未分離123I標(biāo)記物進(jìn)行了對(duì)比(表4)。表4結(jié)果表明：123I標(biāo)記的小分子融合肽在正常小鼠體內(nèi)代謝較快，6 h后在組織的放射性攝取已較低；從放射性在各組織的分布看，在胃中攝取較高，123I標(biāo)記物的代謝有可能是通過胃腸道進(jìn)行的；123I標(biāo)記物在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)在甲狀腺的放射性攝取較低(接近于肌肉組織)，說明標(biāo)記物在體內(nèi)不易發(fā)生脫碘反應(yīng)；除在胃中的1 h和3 h外，標(biāo)記物分離與未分離兩者在正常小鼠體內(nèi)的分布、代謝無明顯差異。

通過上述實(shí)驗(yàn)表明，123I標(biāo)記物在體內(nèi)不易脫碘且具有較高的體外穩(wěn)定性，有必要對(duì)其進(jìn)行更深入的研究。下一步將進(jìn)行123I標(biāo)記的小分子融合肽對(duì)荷Raji細(xì)胞系裸鼠親腫瘤靶向分子顯像研究，探討荷瘤靶向分子顯像的可行性。

3 結(jié) 論

天然銻靶通過121Sb(α，2n)123I反應(yīng)，控制銻靶厚度在62.2～64.3 mg/cm2和α粒子能量在26.5 MeV的情況下，可以得到核純度高達(dá)98.6%的123I。在制備123I的基礎(chǔ)上進(jìn)行了小分子融合肽擬似物的123I標(biāo)記，其標(biāo)記率可達(dá)90%以上。標(biāo)記物123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，123I標(biāo)記物在體內(nèi)不易脫碘且具有較高的體外穩(wěn)定性，其研究結(jié)果為123I顯像藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

表4 分離與未分離的123I標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的分布實(shí)驗(yàn)

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