反相離子對色譜法測定奶粉中核苷酸質量濃度

許彬，張仕華

（廣東雅士利集團有限公司技術中心，廣東 潮州515638）

反相離子對色譜法測定奶粉中核苷酸質量濃度

許彬，張仕華

（廣東雅士利集團有限公司技術中心，廣東 潮州515638）

為檢測奶粉中胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、次黃嘌呤核苷酸5種核苷酸的質量濃度，建立起奶粉中5種核苷酸的反相離子對色譜法。樣品經質量分數為10%乙酸去除蛋白，在流動相為1.4 mmol/L四丁基硫酸氫胺含0.01 mol/L磷酸二氫鉀（pH=4.0）∶甲醇=96∶4的條件下用C18色譜柱分離，紫外檢測波長254 nm，流速1 mL/min，標準曲線法定量。5種核苷酸的平均回收率和樣品重復測定變異系數分別是95.7%，96.0%，90.8%，98.7%，99.3%和0.583%，0.147%，0.257%，0.387%，0.167%。該方法無需進行固相萃取，快速靈敏，簡便準確，適用于奶粉中核苷酸質量濃度的檢測。

反相離子對色譜法；奶粉；核苷酸

0 引 言

核苷酸是由含氮的堿基、核糖或脫氧核糖、磷酸3種分子連接而成[1]，是構成核酸的成分。目前嬰幼兒奶粉中添加的核苷酸主要有5種：胞嘧啶核苷酸（CMP）、 尿嘧啶核苷酸 （UMP）、 腺嘌呤核苷酸（AMP）、 鳥嘌呤核苷酸 （GMP）、 次黃嘌呤核苷酸（IMP）。雖然核苷酸是嬰幼兒的重要營養素，對其生長發育有重要作用，但有一定的含量范圍，過低起不到應有的營養作用，過高則可能對嬰幼兒正常生長發育產生不利影響。所以，建立起適合于嬰幼兒奶粉中核苷酸含量的準確簡便的檢測方法極為重要。

目前，國內外文獻中有許多應用高效液相色譜法進行核苷酸檢測的報道[2-6]，這些方法都難以在企業中應用推廣并將其作為常規檢測。

本研究擬在查閱有關核苷酸檢測資料的基礎上，結合嬰幼兒奶粉和當前企業普遍使用的色譜儀器與耗材的特點，建立起檢測核苷酸質量濃度的準確快捷方法，為企業常規檢測奶粉中核苷酸質量濃度提供技術手段。

1 實 驗

1.1 主要儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，Waters2489紫外檢測器，超聲波， C18（250 mm×4.6mm,5 μm）色譜柱。

1.2 試劑

核苷酸標準品：CMP，UMP，GMP，IMP，AMP（純度≥99%），四丁基硫酸氫胺（純度為99.4%），磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，乙酸，鹽酸，氫氧化鈉，甲醇（色譜純），試劑除指定說明，其余均為分析純。

1.3 核苷酸標準溶液的配置

精確稱取5種核苷酸標準品CMP，UMP，GMP，IMP，AMP各0.010 g，用水定容于100 mL棕色容量瓶中，作為標準儲備液。再用水稀釋成一系列標準工作液進行色譜分析，以峰面積對進樣濃度進行線性回歸。

2 方 法

2.1 色譜條件的建立

（1）色譜柱類型：使用C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱

（2）流動相組成：先配置濃度為0.1 mol/L的磷酸氫二鉀，再配置含濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀的1.4 mmol/L四丁基硫酸氫胺，并用濃度為0.1 mol/L磷酸氫二鉀調其pH值以及加入一定體積的甲醇，根據標樣和樣品色譜圖分離情況，確定流動相的pH值和甲醇體積比。

（3）其他色譜條件：紫外檢測器，檢測波長為254 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2.2 樣品的前處理方法

準確稱取5.00 g樣品,用適量的50℃熱水[1]旋渦混勻溶解，冷卻至室溫后將其放入超聲清洗機（頻率40 kHz）里超聲10 min，然后溶液轉入50 mL容量瓶中,采用3種樣品處理方式沉淀蛋白：質量分數為10%乙酸[2]沉淀、質量濃度為10 g/L偏磷酸、調pH值；用超純水定容至刻度，搖勻過濾，得到清亮的濾液，再使用0.45 μm濾膜過濾，得樣品濾液并進行上機分析。對3種沉淀方式進行比較。

3 結果與分析

3.1 色譜條件的選擇

色譜條件的選擇主要涉及到檢測波長、色譜柱和流動相。5種核苷酸在紫外區域有吸收，通過查閱相關文獻，獲知5種核苷酸在254 nm皆有紫外吸收。目前，C18色譜柱是最常見、用途最廣的反相柱[7]，具有重現性佳，柱效高，易于推廣等作用。核苷酸屬于酸性離子型化合物，要在C18反相色譜住有保留，必須添加陰離子對試劑，使其與溶質離子結合形成疏水性離子對化合物，從而能夠在兩相之間進行分配，故選擇四丁基硫酸氫胺。反相離子對色譜常用的流動相是以水為主體的緩沖溶液，其pH值對分離的影響最大。因為流動相的酸堿度決定了被分析物的解離狀態，從而影響其與離子對的結合程度。因此，改變流動相的pH值是改善分離選擇性的有效方法。通過試驗摸索，發現含0.01 mol/L磷酸二氫鉀的1.4 mmol/L四丁基硫酸氫胺[6]在pH=4.0的條件下能分開5種核苷酸。

以水為主體的流動相中通常添加有機溶劑，如甲醇、乙腈等作為改性劑，其作用是改善締合分子在兩相中的分配。在確定離子對試劑的濃度（1.40 mmol/L）和流動相的pH＝4.0后，又對含離子對試劑的緩沖鹽溶液與甲醇的體積分數比為90∶10，92∶8，94∶6，96∶4，98∶2的流動相進行實驗。結果表明：加入甲醇的體積對5個組分峰的保留時間影響較大，而且對5個組分峰影響的程度不一樣，并直接影響出峰順序及分離度。試驗結果表明，含離子對試劑的緩沖鹽溶液與甲醇的體積分數比為96∶4的流動相對5種核苷酸的分離度效果較好。因而，得到的最佳分析條件是使用C18色譜柱，離子對試劑四丁基硫酸氫銨濃度為1.4 mmol/L且含0.01 mol/L磷酸二氫鉀，甲醇體積分數為4%，pH值為4.0，如圖1所示。

3.2 樣品前處理方式的選擇

樣品的前處理主要考慮的是既能將樣品中的蛋白質分離出去，又能將核苷酸無損失的提取出來。為此我們將樣品用水溶解，通過超聲波振蕩后采用3種樣品處理方式來沉淀蛋白質：10%乙酸、15 g/L偏磷酸、調pH值。酸法沉淀蛋白的方法是將充分振蕩溶解的樣品轉入50 mL容量瓶中，加入5 mL質量分數為10%的乙酸溶液或5 mL質量濃度為15 g/L偏磷酸，定容，充分混勻后用濾紙過濾；調pH值法沉淀蛋白質的方法是先用稀鹽酸溶液將充分振蕩溶解的樣品溶液的pH值調至1.7，靜止1 min后再用氫氧化鈉調pH值至4.5后轉入50 mL容量瓶，定容，混勻，用濾紙過濾。上述濾液通過0.45 μm的濾膜過濾后上機測定。通過對測定色譜圖進行分析后發現：上述3種處理方式對色譜圖中雜質峰的數量和色譜峰形及分離度都有一定的影響，調pH值和加入偏磷酸沉淀蛋白質的試液雜質峰要多于用乙酸沉淀蛋白質的方法。使用乙酸沉淀蛋白效果最好，色譜峰的峰形和分離度最好，而且方便。根據上述處理樣品方法的比較，確定采用質量分數為10%乙酸沉淀蛋白質的樣品處理方法，如圖2所示。

3.3 方法的精密度、線性關系和準確度

按照既定條件連續5次測定同一樣品，用峰面積相對標準偏差計算精密度，結果如表1所示。將核苷酸系列標準工作液按上述色譜條件進樣10 μL，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，通過回歸計算求得回歸方程和相關系數，結果如表2所示。準確度用樣品的回收率來評價，以5個樣品為實驗材料，加入核苷酸混合標準溶液，然后按上述操作步驟進行測定，測定結果如表3所示。

表1 精密度實驗結果

表2 核苷酸標準曲線測定結果

表3 奶粉中核苷酸回收率實驗結果

4 結 論

采用反相離子對高效液相色譜法對奶粉中核苷酸質量濃度進行測定，方法無需進行固相萃取和特殊設備，快速靈敏，操作簡便，易于掌握，其測定精密度和準確度能滿足乳制品分析的要求。因此，可作為常規檢測方法應用。

[1]揚大進，方從容，馬蘭，等.嬰幼兒配方奶粉中核苷酸含量的測定方法研究[J].中國食品衛生雜志，2003，15(6):497.

[2]張燕婉，魯紅軍，王津生.高效液相色譜法測定食品中核苷酸的含量[J].食品科學，1994，6:59-62.

[3]任一平，黃百芬，連國義，等.應用HPLC反相色譜快速測定增鮮味精中的鳥苷酸和肌苷酸[J].食品與發酵工業，1994，6:36-41.

[4]黃曉蘭，李科德，陳云華.15種核酸水解產物的高效液相分離及其在酵母抽提物分析中的應用[J].分析化學研究簡報，2000，28(12):1504-1507.

[5]BRENDON D G，HARVEY E I.Development and Application of a Liquid Chromatographic Method for Analysis of Nucleotide and Nucleosides in Milk and Infant Formulas[J].International Dairy Journal，2007(17):596-605.

[6]張秋梅，郝巖平，宋戈.高效液相色譜法測定乳粉中的核苷酸[J].中國乳品工業，2009，4：51-54.

[7]劉國詮，余兆樓.色譜柱技術[M].北京：化學工業出版社，2004,199.

Determination of nucleotides in infant formula milk powder by reversed-phase ion pair chromatography

XU Bin,ZHANG Shi-hua
(Guangdong Yashili Group Co.,Ltd Technology Center，Chaozhou 515638,China)

For the determination of 5 nucleotides amount in infant formula milk powder,the Reversed-Phase Ion Pair Chromatography detector method was established.We established the method in which 10%acetic acid was used for elimination of protein,C18 column and the liquid phase of 1.4 mmol/L Tetarbutylammonium hydrogen sulfate(0.01 mol/L KH2PO4and pH=4.0)for isolation and the nucleotides were determined quantitatively by standard curve method at the UV 254nm and the flow of 1 mL/min.The average recovery rates of cytidine,uridine,adenosine,guanosine and inosine were 95.7% 、96.0% 、90.8% 、98.7% 、99.3%,respectively and the coefficient variance were 0.583% 、0.147%、0.257%、0.387%、0.167%.Without SPE,the method was able to quickly,accurate and sensitive detect nucleotides amount in infant formula milk powder.

Reversed-Phase Ion Pair Chromatography；milk powder；nucleotides

TS252.7

A

1001-2230（2012）04-0045-03

2011-12-20

許彬(1983-)，男，工程師，研究方向為食品安全和食品檢測技術。