中肋骨條藻在不同營養鹽條件下的熒光光譜特征研究＊

蔣鳳華，趙美麗，史振平，鄭 立，陳軍輝，王小如，黎先春

（1.國家海洋局 第一海洋研究所海洋生態中心，山東 青島266061；2.青島科技大學 化工學院，山東 青島266042）

中肋骨條藻在不同營養鹽條件下的熒光光譜特征研究＊

蔣鳳華1，趙美麗1，史振平2，鄭 立1，陳軍輝1，王小如1，黎先春1

（1.國家海洋局 第一海洋研究所海洋生態中心，山東 青島266061；2.青島科技大學 化工學院，山東 青島266042）

采用實驗生態學方法，探討了營養鹽條件變化對中肋骨條藻活體細胞和光合色素熒光光譜的影響。結果表明，光合色素的熒光激發光譜和發射光譜均比活體藻細胞的多一個熒光峰，且熒光峰最大值向短波方向移動；營養鹽條件改變時，活體藻細胞的熒光光譜特征基本不變，光合色素的熒光光譜特征由于色素組成比例發生變化而使熒光光譜特征發生改變。研究結果還顯示營養鹽條件的改變會影響光合色素的熒光光譜特征，應用光譜技術對赤潮藻進行監測和分析時需要考慮環境條件的影響。

赤潮藻；中肋骨條藻；熒光光譜；營養鹽

（高 峻 編輯）

因為全球特別是我國近海赤潮的頻發，所以對浮游植物種類和數量的監測分析方法的探討已成為研究的焦點。吸收光譜法和熒光光譜法作為常規的分析手段，可用于浮游植物種類的識別和數量的測量，對于赤潮監測具有重要意義。藻體所含色素種類及其組成比例決定了藻類吸收譜的形狀，而色素濃度及包裹效應主要影響吸收譜的值［1－2］。藻類熒光隨著培養時間［3］、光照條件［4］、營養鹽條件［3］、微量元素含量［5］及污染物的存在等而變化［6－10］。熒光特性方面的研究較多，對光譜特征研究較少。國內唐曉靜等、蘇榮國等對不同光照條件下東海典型赤潮藻的光譜特征進行研究，并進行藻類的識別［11－12］。赤潮發生時現場環境條件的不同會引起藻類光譜的變化。我們以中肋骨條藻為研究對象，測量活體藻細胞及其光合色素的熒光光譜特征，分析營養鹽條件改變對熒光光譜性質的影響，為建立浮游植物的光譜分析方法進行有益探索，并對赤潮的監測和預測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 樣品與實驗條件

實驗所用中肋骨條藻（Skeletonemacostatum（Greville）Cleve）由國家海洋局第一海洋研究所提供，藻種于2002－05采自東海長江口海域，分離純化后于20℃保存在f/2培養液中，光照度約為3 000Lx，光暗比為12h∶12h，光源為白色日光燈。以250mL玻璃三角瓶為培養容器，經體積分數為20%的HCl溶液浸泡處理后，用超純水沖洗干凈，蒸汽滅菌（121℃，15min）。海水用孔徑0.45μm的醋酸纖維濾膜過濾后，高壓鍋煮沸滅菌。

培養實驗在4種營養鹽條件下進行。除了f/2培養液條件，另3種營養鹽條件為固定PO4－P濃度為2 μmol/L，使NO3－N濃度分別為16，64和128μmol/L，即N/P比分別為8∶1，16∶1和64∶1。首先在上述3種營養鹽條件下對微藻進行培養，然后取10mL指數生長期的藻液接種到500mL培養液進行正式實驗，培養周期15d。每組3個平行。培養條件與藻種保存條件相同。培養期間適當振蕩，接種及取樣時均進行滅菌處理。

實驗期間每天定時取樣5mL藻液直接進行微藻生長和熒光光譜的測定；另取20mL藻液用GF/F濾膜過濾后，將濾膜放置于15mL玻璃離心館中，加入10mL體積分數為90%丙酮，于4℃在暗處放置24h，以提取其中的光合色素，取上清液進行熒光光譜測量［13］。

1.2 微藻生長和熒光光譜的測量

以微藻的活體葉綠素熒光值表示微藻的生長［14］。直接用Hitachi F－4500熒光分光光度計（配以1cm石英比色皿）測定活體葉綠素熒光值，發射和激發狹縫均為5.0nm。激發波長（λex）466nm，發射波長（λem）600～750nm，以680nm處的熒光強度（arbitrary unit，a.u.）變化表示藻的生長變化。

測熒光激發光譜時，λem為680nm，λex范圍為360～600nm；測定熒光發射光譜時，λex為440nm，λex范圍為600～800nm［5，13］。掃描速度1 200nm/min。

1.3 光譜數據的預處理

將掃描的光譜數據導出，在Matlab軟件中用窗口移動多項式平滑和最大歸一化方法對數據進行平滑和歸一化處理，以消除噪音、基線漂移和光譜強度的差別，處理后的光譜圖只反映樣品的光譜形狀。

2 結果與討論

2.1 不同營養鹽條件對中肋骨條藻生長的影響

實驗中，微藻的細胞密度和活體葉綠素熒光強度之間存在線性關系，因而以葉綠素熒光強度的變化表示微藻生長。中肋骨條藻活體葉綠素熒光強度的變化，即微藻的生長符合指數生長曲線，第1～3天處于緩滯期，從第4天開始進入指數生長期。在f/2營養液和N/P比例為64∶1條件下，藻的生長在第10天達到最大值；而在N/P比例為16∶1和8∶1條件下，藻密度均在第6天達到最大值（圖1）。營養鹽濃度越高，藻密度越大。這與劉春穎等［13］發現的低營養鹽條件下亞心形扁藻的生長狀況普遍較差相一致。

圖1 不同營養鹽條件下中肋骨條藻的生長曲線Fig.1 Growth curves of Skeletonemacostatumin different nutrient concentrations

1.2 不同營養鹽條件對中肋骨條藻熒光光譜的影響

2.2.1 熒光激發光譜

圖2為預處理前后f/2培養液條件下不同培養時間的中肋骨條藻光合色素的熒光激發光譜圖。光合色素的熒光強度隨藻密度增加而增大，因而不同時間的熒光光譜形狀存在較大差異；由于峰強高低不同，使得峰強較弱的光譜形狀顯現不出來（圖2a）。經過平滑和歸一化處理后（圖2b），能夠有效消除受噪音、儀器影響而產生的平峰現象；消除了量的差別之后，波譜只反映了物種的形狀，有助于對比不同物種間波譜的特征差異。由于第7天時N/P比為8∶1條件下藻的生長已進入衰亡期，因而只選取第6天的光譜數據并平滑和歸一化處理后進行比較，分析營養鹽條件改變對熒光光譜的影響。

圖2 不同時期f/2培養液條件下中肋骨條藻光合色素的熒光激發光譜Fig.2 Fluorescence excitation spectra of photosynthetics pigments of Skeletonemacostatum in f/2culture medium in at different periods

圖3為發射波長為680nm時不同營養鹽條件下中肋骨條藻第6天時活體藻細胞和光合色素的熒光激發光譜。4種營養鹽條件下熒光激發光譜形狀基本一致，熒光峰位置沒有明顯變化。活體細胞的熒光激發光譜在400～480nm和500～570nm出現2個強度相近的熒光寬峰，最大值分別位于440nm和530nm，在470nm處存在次大峰；分別為Chl－a、類胡蘿卜素和Chl－b的特征激發波長［15］。但是，也有研究表明含有Chl－c的微藻光譜中位于綠光區468nm附近的激發峰是Chl－c的強峰［16］，主要是由Chl c1，c2，c3及其衍生物引起的。530～545nm的強吸收是類胡蘿卜素的典型吸收帶，而胡蘿卜素的吸收帶可位于425～500nm［17］。

圖3 第6天時不同營養鹽條件下中肋骨條藻的熒光激發光譜（λem＝680nm）Fig.3 Fluorescence excitation spectra of Skeletonemacostatumin 6th day under different nutrient condition（λem＝680nm）

相對于活體細胞熒光光譜，光合色素的熒光激發光譜中2個熒光寬峰分別藍移至360～450nm和490～550nm，并且在415，510和540nm出現最大熒光值，分別對應于活體細胞440nm處的葉綠素、類胡蘿卜素和褐藻黃素的典型吸收［17］，但是，510nm和540nm處的熒光強度比較接近，并且較415nm處的熒光強度明顯偏低。提取光合色素的熒光最大值和熒光最大值均向短波方向移動，可能是由于色素提取液中細胞膜被破壞，不存在細胞色素層疊效應的原因。

比較3種低營養鹽條件下2個熒光峰范圍的熒光強度變化，可發現隨N濃度降低（64∶1降至8∶1），530nm處的熒光強度比值升高，即藻體中胡蘿卜素和類胡蘿卜素的比例增加。提取色素熒光光譜中同樣是N/P為8∶1條件下類胡蘿卜素和褐藻黃素（510nm和540nm處熒光）比例相對最高。

進一步分析光合色素熒光激發光譜中415nm，510nm和540nm處熒光強度的比值隨培養時間的變化（圖4）。

葉綠素與類胡蘿卜素和褐藻黃素的比例（I415nm/I510nm和I415nm/I540nm）的變化趨勢與藻生長曲線相似，表明藻體內色素組成比例與生長周期有關，但是第4天比值最高。此外，f/2培養液條件下I415nm/I510nm和I415nm/I540nm在整個培養周期內均最大，而N/P比為8∶1條件下，熒光峰強度的比例均最小，表明不同營養鹽條件下藻體內的色素組成發生了改變，而類胡蘿卜素的比例有所增加。研究表明，在環境脅迫條件下，Chl－a含量較類胡蘿卜素更敏感，即Chl－a降低幅度要大于類胡蘿卜素［17］，這可能是低營養鹽條件下微藻的生長受到脅迫會產生過氧自由基，類胡蘿卜素和褐藻黃素等作為微藻體內的抗氧化劑，其含量增加是微藻適應環境的一種表現。

圖4 不同營養鹽條件下光合色素激發光譜中2種熒光強度比例隨培養時間的變化Fig.4 The changes of 2fluorescence intensity ratioes of photosynthetic pigments with the culture time under different nutrient conditions

2.2.2 熒光發射光譜

激發波長為440nm時，活體細胞的激發光譜在650～750nm范圍內出現1個熒光峰，最大值在680 nm，為Chl－a的典型熒光峰（圖5a）。營養鹽條件的改變對熒光峰的形狀沒有影響。但是，提取色素的激發光譜在600～750nm存在2個熒光峰（圖5b），最大值分別在636nm和669nm，分別為Chl－c和Chl－a的熒光發射峰［19］，并且光合色素熒光發射光譜中Chl－a的位置同樣向短波方向移動。這同樣是由于色素提取液中細胞膜被破壞，不存在細胞色素層疊效應的原因。

圖5 第6天時不同營養鹽條件下中肋骨條藻的熒光發射光譜Fig.5 Fluorescence emission spectra of Skeletonema costatum in 6th day under different nutrient conditions

進一步分析不同營養鹽條件下2個熒光峰強度之比（I636nm/I670nm）的變化發現，不同營養鹽條件下的熒光強度比例不同，即營養鹽條件的改變影響到Chl－a和Chl－c的相對比例（圖6）。在第3天之前，熒光峰的比值較小，這可能是由于在生長初期藻密度較低，色素含量同樣很低的原因；2個熒光峰強度的比值在第6～8天達到最大，在衰亡期變小，同樣表明藻體內的色素比例會隨生長階段的不同而發生改變。

圖6 不同營養鹽條件下光合色素發射光譜中熒光強度比例隨培養時間的變化Fig.6 The changes plot of fluorescence intensity ratio of photosynthetic pigments with the culture under different nutrient conditions

3 結 語

研究營養鹽條件變化對中肋骨條藻活體細胞和光合色素的熒光激發光譜和熒光發射光譜的影響，結果表明：

1）光合色素的熒光激發光譜和發射光譜均比活體藻細胞多一個熒光鋒，并且位置均較活體藻細胞向短波方向移動；

2）營養鹽條件改變時，活體藻細胞的熒光光譜特征基本不變；但是營養鹽濃度較低時，藻細胞中輔助色素的比例增加，從而引起熒光激發光譜和發射光譜發生變化。

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Study on the Characteristics of Fluorescence Spectra ofSkeletonemacostatumUnder Different Nutrient Conditions

JIANG Feng－hua1，ZHAO Mei－li1，SHI Zhen－ping2，ZHENG Li1，CHEN Jun－hui1，WANG Xiao－ru1，LEE FRANK S C2
（1.ResearchCenterofMarineecology，TheFirstInstituteofOceanography，SOA，Qingdao 266061，China；2.Collegeofchemicalengineering，QingdaoUniversityofScienceandTechnology，Qingdao 266042，China）

The effects of nutrient conditions on living cells and fluorescence spectra ofSkeletonemacostatumwere studied by using experimental ecological methods.An extra fluorescent peak was found in both excitation and emission spectrum of photosynthetic pigments and the positions of the fluorescence peaks of photosynthetic pigments were blue－shifted compared to those of the living cells.When the nutrient conditions changed，the characteristics of fluorescence spectra of living cells were basically kept the same，however the characteristics of fluorescence spectra of photosynthetic pigments were changed when the ratio of pigments compositions altered.The results indicated that the changes of nutrient conditions affected the characteristics of fluorescence spectra of photosynthetic pigments，and the environment conditions should be considered when applying the spectroscopic methodology to monitor and analyze red tide algae.

red tide algae；Skeletonemacostatum；fluorescence spectra；nutrient

December 15，2010

P733.3

A

1671－6647（2012）02－0229－07

2010－12－15

項目資助：國家高技術研究發展計劃——赤潮現場快速監測與檢測技術（2007AA092001）；海洋赤潮災害立體監測技術與應用國家海洋局重點實驗室開放課題——長江口赤潮監控區常見赤潮藻種光譜特性研究（200811）

蔣鳳華（1977－），山東德州人，副研究員，主要從事海洋環境化學方面研究.E－mail：jiangfh＠fio.org.cn