α-亞麻酸對赤潮異彎藻生長的抑制作用

夏鈺妹,孫 雪,徐年軍,錢 偉 (寧波大學海洋學院,應用海洋生物技術教育部重點實驗室,浙江 寧波 315211)

近年來,赤潮的頻發對海洋生態環境、漁業資源和海水養殖業造成了直接或間接的負面影響[1].因此,如何有效地控制其爆發,已成為當前污染生態學研究的熱點之一[2-5].脂肪酸在藻類中普遍存在,主要為偶數碳的飽和與不飽和脂肪酸,Gniazdowska等[6]與 Kakisawa等[7]已報道其具有化感抑藻作用,張庭廷等[8]在此基礎上研究了脂肪酸類物質的抑藻效應,認為不飽和脂肪酸的抑藻效果明顯好于相同碳鏈的飽和脂肪酸.利用水生物分泌的天然脂肪酸,一方面可以抑藻,另一方面在水體中不會大量聚集或造成二次污染.目前,采用天然脂肪酸抑藻的應用實例還不多.本課題組在對滸苔抑藻物質的研究中發現,滸苔中抑藻物質是一類脂肪酸類物質,并對其進行了制備分離,GC-MS分析結果表明其主要成分是α-亞麻酸.本文研究了不同濃度的α-亞麻酸對赤潮異彎藻生長的抑制作用,并且從細胞膜滲透性、抗氧化酶系和光合放氧量等方面探討了其抑制機理,旨在為開發新的殺藻劑提供一定的理論基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)由寧波大學海洋生物工程重點實驗室藻種室提供,經f/2[9]海水培養基培養,培養條件:溫度 25℃,鹽度25‰,光強 60μmol/(m2·s),光周期 L:D(12h:12h),每天定時搖晃藻培養瓶3次,以防止其貼壁生長.

α-亞麻酸標準品購自Sigma公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 抑藻實驗 用新鮮培養基將處于對數生長期的赤潮異彎藻稀釋至 15×104cells/mL,在100mL的三角瓶中分別加入50mL藻液,將α-亞麻酸(0,2,4,8,12μL/L)分別加入藻液中.置于光照培養箱中培養,培養過程中定時搖動,每組實驗設3個平行.每天定時取樣,在Olympus光學顯微鏡下用血球計數板進行計數,實驗進行 7d.繪制出α-亞麻酸與藻密度的關系曲線,計算藻類抑制率(η),并得出半抑制濃度(IC50).

式中:η為抑制率;N0為對照組藻密度;N為實驗組藻密度.

1.2.2 藻細胞膜滲透性的測定 用新鮮培養基將處于對數生長期的赤潮異彎藻稀釋至 15×104cells/mL,在 5000mL三角瓶中加入4000mL藻液,α-亞麻酸按2.4μL/L濃度加入藻液中,對照組不加 α-亞麻酸,每組實驗設 3個平行.于 0,4,8,12,24,36h分別取樣,離心,收集藻細胞,冷凍干燥,備用.各稱取15mg不同時間取樣的處理組和對照組樣品,加入蒸餾水 8mL,100℃水浴 10min,離心得上清液,分別用原子吸收分光光度計法(TAS-990)測定藻細胞中Na+、K+、Mg2+和Ca2+的濃度,以表征藻細胞滲透性的變化.

1.2.3 藻細胞可溶性蛋白、超氧化物歧化酶活性(SOD)、過氧化物酶活性(POD)、過氧化氫酶活性(CAT)和丙二醛含量(MDA)測定 各稱取 20mg不同時間取樣的處理組和對照組干燥樣品,加入10mL預冷的磷酸緩沖液(pH7.6),冰浴下超聲波破碎(超聲5s,間隔5s,工作次數40,功率400W,重復3次).4℃下8000r/min離心15min,收集上清液.

可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍法;超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑(NBT)法[10];過氧化物酶(POD)采用愈創木酚法[11];過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(南京建成生物研究所);丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法[12].

1.2.4 藻細胞光合放氧量的測定 用新鮮培養基將處于對數生長期的赤潮異彎藻液稀釋至15×104cells/mL,實驗組中,α-亞麻酸按半抑制濃度加入藻液中,對照組不加 α-亞麻酸.各取藻液2mL加入已校正完畢的液相氧電極(Hansatech,England)的反應室中,打開光源,穩定后進行測定.

1.3 數據分析

統計分析等數據處理在 Origin 8.0和SPASS18.0軟件上進行,不同處理間的指標值先進行單因素方差分析(One-way ANOVA),然后進行LSD(L)和Duncan(D)多重比較.

2 結果與討論

2.1 α-亞麻酸對赤潮異彎藻生長的影響

從圖1可以看出,α-亞麻酸對赤潮異彎藻具有顯著的抑制作用,隨著濃度的增加,抑制作用加劇.圖1顯示,較高濃度的α-亞麻酸對赤潮異彎藻有明顯的抑制作用,濃度為2μL/L時,其藻細胞密度明顯低于對照組,最大抑制率達42%;濃度為4μL/L時,3d后能保持60%的抑制率,其后能持續抑制到實驗結束;濃度大于8μL/L時,藻密度維持在較低水平,第2d抑制率達67%.圖2為第7dα-亞麻酸對赤潮異彎藻的抑制率,從圖2可以看出,隨著α-亞麻酸濃度的增加,其對赤潮異彎藻的抑制率明顯上升.從而,可以計算出 α-亞麻酸對赤潮異彎藻的半抑制濃度為2.4μL/L.

對于赤潮異彎藻,研究表明多種物質對其具有抑藻效應.孔石莼(U. pertus)的新鮮組織、干粉末和水相提取物對赤潮異彎藻、海洋原甲藻(Prorocentrum mican)和亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)的生長具有抑制作用,孔石莼能夠分泌某種化感物質,抑制共培體系中赤潮藻的生長[13-15].緣管滸苔(Enteromorpha linza)、小珊瑚藻(Corallina pilulifera)對赤潮異彎藻具有克生效應,緣管滸苔新鮮組織和干粉末對赤潮異彎藻生長均有顯著的抑制作用,在相對高濃度下抑制作用較強,甚至殺死全部赤潮異彎藻細胞;小珊瑚藻組織甲醇提取物對赤潮異彎藻具有較高的抑制活性[16-17].龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)對赤潮異彎藻和海洋原甲藻具有生長抑制效應,其對兩種赤潮藻的生長抑制作用均具有劑量效應,且隨著起始密度的增加,抑制作用增強[18].這些物質對赤潮異彎藻的抑藻效應得到一定的驗證,但具體是何種成分在起作用并不明確.

圖1 不同濃度α-亞麻酸對赤潮異彎藻生長的影響Fig.1 The effects of different concentration of α-linolenic acid on the growth of H. akashiwo

圖2 不同濃度的α-亞麻酸對赤潮異彎藻的抑制率Fig.2 The inhibitory ratio of different concentration of α-linolenic acid on the growth of H. akashiwo

張庭延等[19]從普生輪藻(Chara vulgaris)中分離得到3種脂肪酸類化感物質:亞油酸、棕櫚酸和豆蔻酸,發現這 3種脂肪酸具有不同程度的抑藻作用,并將亞油酸作用于銅綠微囊藻進行探求,證明其具有明顯的抑藻作用.鄭春艷等[20]認為亞油酸、水楊酸和羥基苯甲酸對池塘水華混合藻類均有顯著的抑制作用,其中,亞油酸的抑制作用最強.李玉瑛等[21]研究了鼠李糖脂對 5種赤潮藻類(塔瑪亞歷山大藻,赤潮異彎藻,雙突角毛藻,柔弱角毛藻和新月菱形藻)生長的影響,當 15mg/L的鼠李糖脂加入到不同藻液中時,會使這 5種藻細胞均遭到不可逆的破壞.Aliotta等[22]經過研究認為α-亞麻酸具有一定的抑藻活性,其抑藻活性主要來自于其氧化產物.從本研究可以看出,α-亞麻酸作用于赤潮異彎藻,其抑藻效果也相當明顯.

2.2 α-亞麻酸對赤潮異彎藻細胞膜透性的影響

從圖3可以看出,α-亞麻酸對赤潮異彎藻的細胞內Na+、K+、Mg2+和Ca2+有不同程度的影響.對照組中細胞內的Na+、K+、Mg2+和Ca2+在 0～36h內變化不明顯,而實驗組細胞內金屬離子大量滲出.圖3A中,Na+濃度在12h開始下降,在36h下降明顯(P＜0.05);圖3B中,K+在4h開始下降,8h下降明顯(P＜0.05);Mg2+在4h就出現明顯下降,36h時,實驗組Mg2+和對照組差異顯著(P＜0.01);Ca2+在4h出現明顯下降,在36h時差異顯著(P＜0.01),說明加入α-亞麻酸后,細胞膜的透性明顯增加,細胞內離子大量滲出,而在這4種離子中,Ca2+下降趨勢較明顯,這與 Ca2+作為膜的穩定劑,在調節細胞膜透性方面起著重要的作用有關.

細胞內物質的釋放可以表征細胞膜的完整性[23].細胞膜是細胞的屏障,控制著細胞內的物質交換,具有選擇透性,能將細胞外的K+選擇性的轉移至細胞內,而將細胞內的Na+轉移至細胞外.抑藻物質能改變細胞膜的透性,造成細胞內的Na+、K+、Mg2+和Ca2+外滲.在環境脅迫下,細胞膜被破壞,導致細胞內含物滲出的研究已經有許多報道.金屬離子、除草劑等有毒物質能破壞斜生柵藻(Trebouxia erici)、小球藻(Chlorella sp.)等藻類的細胞膜[24-25].蘆葦化感物質對銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)和普通小球藻(C. vulgaris)細胞膜透性具有不同程度的影響[26].在蘆葦化感物質EMA的作用下,銅綠微囊藻細胞內 K+、Mg2+和Ca2+的滲出量約為對照組的1.5～2.0倍,說明EMA增加了離子的滲出量,破壞了細胞膜的滲透性.酚酸通過破壞銅綠微囊藻的細胞壁而起到抑制作用[27].所以,在本研究中,加入α-亞麻酸后,使赤潮異彎藻的細胞壁受到一定的破壞,細胞膜的通透性增加,細胞內的離子外滲,導致藻的生長受到抑制.

圖3 α-亞麻酸對赤潮異彎藻Na+、K+、Mg2+和Ca2+滲出率的影響Fig.3 The effects of α-linolenic acid on the efflux of Na+、K+、 Mg2+ and Ca2+ of H. akashiwo

2.3 α-亞麻酸對赤潮異彎藻細胞抗氧化酶系的影響

生物在長期的進化過程中,為了防止體內過多活性氧對機體的傷害,形成了一套有效的抗氧化防御系統.SOD、POD、CAT是植物體內的重要保護酶,在清除自由基過程中起著重要的作用.所以,在外環境的刺激下,細胞內的酶活強弱直接關系到抵抗環境傷害的能力.在正常條件下,細胞內活性氧(O2-)的產生和分解之間處于一種平衡狀態,使 O2-等自由基處于適宜的水平.SOD在清除自由基中起重要作用,對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用,此酶能清除超氧陰離子自由基(O2-),保護細胞免受損失,SOD活性的高低與植物的抗逆性有一定的相關性[28].

國內外的研究顯示,植物化感物質可能的抑藻機理為破壞葉綠素,破壞細胞膜,影響某些酶的活性.藻細胞在受到外界刺激時,抗氧化系統會有應激性的反應.久效磷、Cd等脅迫都可能對微藻細胞的抗氧化酶系統進行破壞,使SOD、POD活性降低,MDA 含量升高[29-30].唐萍等[31]發現鳳眼蓮能使柵藻(Scenedesmus arcuatus)藻體黃化,葉綠體、線粒體、類囊體、細胞壁等細胞器受到損傷,藻細胞可溶性蛋白含量直線下降,SOD和POD活性先升高后下降,MDA含量則上升.

從表1可以看出,加入α-亞麻酸后,赤潮異彎藻的蛋白質含量較穩定,24h后,實驗組和對照組比較出現一定的下降.實驗組 SOD、POD、CAT和MDA活性呈現先上升后下降的趨勢,4h時,實驗組的CAT活性明顯高于對照(P＜0.01),隨后迅速下降,8h時明顯低于對照組(P＜0.001);SOD和POD則在 8h時明顯高于對照組,其后逐漸下降;CAT和MDA逐漸增加,在 12h達到最高值.SOD的主要功能是清除O2-,O2-可被SOD歧化,產生 H2O2,它可與 O2-相互作用產生更多的自由基OH,OH-和O2-,而OH-毒性極大,引起膜脂過氧化作用.在生物體內,O2-是通過SOD歧化分解的,H2O2通過CAT和POD氧化分解.所以,它們三者是協同作用,使生物體內的自由基維持在一個低的水平.MDA是生物膜系統脂質過氧化的產物之一,其濃度表征了脂質過氧化強度和膜系統受傷害程度.本實驗中MDA逐漸上升表明,隨著接觸時間的增加,SOD活性的下降,活性氧的產生和清除之間的平衡被破壞,細胞的膜脂質過氧化程度加劇,細胞膜的結構受到破壞.隨著藻細胞的部分死亡,藻體分解,藻細胞內的MDA也隨著消失,故在36h出現下降的趨勢.

表1 α-亞麻酸對赤潮異彎藻的可溶性蛋白、CAT、SOD、POD和MDA的影響Table 1 The effects of α-linolenic acid on the soluble protein, CAT, SOD, POA, MDA content of H. akashiwo

2.4 α-亞麻酸對赤潮異彎藻光合放氧量的影響

圖4 α-亞麻酸對赤潮異彎藻光合放氧量的影響Fig.4 The effects of α-linolenic acid on the photosynthetic oxygen of H. akashiwo

從圖4可以看出,隨著實驗的進行,對照組的光合放氧量變化不顯著,而α-亞麻酸處理組的光合放氧量則逐漸減少,出現顯著的變化.這表明赤潮異彎藻細胞內的光合酶系如 RuBP羧化酶、PEP羧化酶、葉綠體反應、光系統活力等受到了一定程度的影響[32],從而導致藻細胞的光合作用受到抑制,生長速率下降.

3 結語

α-亞麻酸對赤潮異彎藻具有一定的生長抑制作用,其抑制機理可能是先破壞藻細胞膜的通透性,以改變細胞內金屬離子的滲出率.同時,細胞內的抗氧化酶系活性降低,藻細胞的光合放氧量明顯下降,最終表現為赤潮異彎藻生長受到抑制.

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