α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻生長的抑制作用

夏鈺妹,孫 雪,徐年軍,錢 偉 (寧波大學(xué)海洋學(xué)院,應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 寧波 315211)

近年來,赤潮的頻發(fā)對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境、漁業(yè)資源和海水養(yǎng)殖業(yè)造成了直接或間接的負(fù)面影響[1].因此,如何有效地控制其爆發(fā),已成為當(dāng)前污染生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[2-5].脂肪酸在藻類中普遍存在,主要為偶數(shù)碳的飽和與不飽和脂肪酸,Gniazdowska等[6]與 Kakisawa等[7]已報(bào)道其具有化感抑藻作用,張庭廷等[8]在此基礎(chǔ)上研究了脂肪酸類物質(zhì)的抑藻效應(yīng),認(rèn)為不飽和脂肪酸的抑藻效果明顯好于相同碳鏈的飽和脂肪酸.利用水生物分泌的天然脂肪酸,一方面可以抑藻,另一方面在水體中不會(huì)大量聚集或造成二次污染.目前,采用天然脂肪酸抑藻的應(yīng)用實(shí)例還不多.本課題組在對(duì)滸苔抑藻物質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn),滸苔中抑藻物質(zhì)是一類脂肪酸類物質(zhì),并對(duì)其進(jìn)行了制備分離,GC-MS分析結(jié)果表明其主要成分是α-亞麻酸.本文研究了不同濃度的α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻生長的抑制作用,并且從細(xì)胞膜滲透性、抗氧化酶系和光合放氧量等方面探討了其抑制機(jī)理,旨在為開發(fā)新的殺藻劑提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)由寧波大學(xué)海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種室提供,經(jīng)f/2[9]海水培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件:溫度 25℃,鹽度25‰,光強(qiáng) 60μmol/(m2·s),光周期 L:D(12h:12h),每天定時(shí)搖晃藻培養(yǎng)瓶3次,以防止其貼壁生長.

α-亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抑藻實(shí)驗(yàn) 用新鮮培養(yǎng)基將處于對(duì)數(shù)生長期的赤潮異彎藻稀釋至 15×104cells/mL,在100mL的三角瓶中分別加入50mL藻液,將α-亞麻酸(0,2,4,8,12μL/L)分別加入藻液中.置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)過程中定時(shí)搖動(dòng),每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行.每天定時(shí)取樣,在Olympus光學(xué)顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 7d.繪制出α-亞麻酸與藻密度的關(guān)系曲線,計(jì)算藻類抑制率(η),并得出半抑制濃度(IC50).

式中:η為抑制率;N0為對(duì)照組藻密度;N為實(shí)驗(yàn)組藻密度.

1.2.2 藻細(xì)胞膜滲透性的測定 用新鮮培養(yǎng)基將處于對(duì)數(shù)生長期的赤潮異彎藻稀釋至 15×104cells/mL,在 5000mL三角瓶中加入4000mL藻液,α-亞麻酸按2.4μL/L濃度加入藻液中,對(duì)照組不加 α-亞麻酸,每組實(shí)驗(yàn)設(shè) 3個(gè)平行.于 0,4,8,12,24,36h分別取樣,離心,收集藻細(xì)胞,冷凍干燥,備用.各稱取15mg不同時(shí)間取樣的處理組和對(duì)照組樣品,加入蒸餾水 8mL,100℃水浴 10min,離心得上清液,分別用原子吸收分光光度計(jì)法(TAS-990)測定藻細(xì)胞中Na+、K+、Mg2+和Ca2+的濃度,以表征藻細(xì)胞滲透性的變化.

1.2.3 藻細(xì)胞可溶性蛋白、超氧化物歧化酶活性(SOD)、過氧化物酶活性(POD)、過氧化氫酶活性(CAT)和丙二醛含量(MDA)測定 各稱取 20mg不同時(shí)間取樣的處理組和對(duì)照組干燥樣品,加入10mL預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH7.6),冰浴下超聲波破碎(超聲5s,間隔5s,工作次數(shù)40,功率400W,重復(fù)3次).4℃下8000r/min離心15min,收集上清液.

可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)法;超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[10];過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚法[11];過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(南京建成生物研究所);丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法[12].

1.2.4 藻細(xì)胞光合放氧量的測定 用新鮮培養(yǎng)基將處于對(duì)數(shù)生長期的赤潮異彎藻液稀釋至15×104cells/mL,實(shí)驗(yàn)組中,α-亞麻酸按半抑制濃度加入藻液中,對(duì)照組不加 α-亞麻酸.各取藻液2mL加入已校正完畢的液相氧電極(Hansatech,England)的反應(yīng)室中,打開光源,穩(wěn)定后進(jìn)行測定.

1.3 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析等數(shù)據(jù)處理在 Origin 8.0和SPASS18.0軟件上進(jìn)行,不同處理間的指標(biāo)值先進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),然后進(jìn)行LSD(L)和Duncan(D)多重比較.

2 結(jié)果與討論

2.1 α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻生長的影響

從圖1可以看出,α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻具有顯著的抑制作用,隨著濃度的增加,抑制作用加劇.圖1顯示,較高濃度的α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻有明顯的抑制作用,濃度為2μL/L時(shí),其藻細(xì)胞密度明顯低于對(duì)照組,最大抑制率達(dá)42%;濃度為4μL/L時(shí),3d后能保持60%的抑制率,其后能持續(xù)抑制到實(shí)驗(yàn)結(jié)束;濃度大于8μL/L時(shí),藻密度維持在較低水平,第2d抑制率達(dá)67%.圖2為第7dα-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻的抑制率,從圖2可以看出,隨著α-亞麻酸濃度的增加,其對(duì)赤潮異彎藻的抑制率明顯上升.從而,可以計(jì)算出 α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻的半抑制濃度為2.4μL/L.

對(duì)于赤潮異彎藻,研究表明多種物質(zhì)對(duì)其具有抑藻效應(yīng).孔石莼(U. pertus)的新鮮組織、干粉末和水相提取物對(duì)赤潮異彎藻、海洋原甲藻(Prorocentrum mican)和亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)的生長具有抑制作用,孔石莼能夠分泌某種化感物質(zhì),抑制共培體系中赤潮藻的生長[13-15].緣管滸苔(Enteromorpha linza)、小珊瑚藻(Corallina pilulifera)對(duì)赤潮異彎藻具有克生效應(yīng),緣管滸苔新鮮組織和干粉末對(duì)赤潮異彎藻生長均有顯著的抑制作用,在相對(duì)高濃度下抑制作用較強(qiáng),甚至殺死全部赤潮異彎藻細(xì)胞;小珊瑚藻組織甲醇提取物對(duì)赤潮異彎藻具有較高的抑制活性[16-17].龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)對(duì)赤潮異彎藻和海洋原甲藻具有生長抑制效應(yīng),其對(duì)兩種赤潮藻的生長抑制作用均具有劑量效應(yīng),且隨著起始密度的增加,抑制作用增強(qiáng)[18].這些物質(zhì)對(duì)赤潮異彎藻的抑藻效應(yīng)得到一定的驗(yàn)證,但具體是何種成分在起作用并不明確.

圖1 不同濃度α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻生長的影響Fig.1 The effects of different concentration of α-linolenic acid on the growth of H. akashiwo

圖2 不同濃度的α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻的抑制率Fig.2 The inhibitory ratio of different concentration of α-linolenic acid on the growth of H. akashiwo

張庭延等[19]從普生輪藻(Chara vulgaris)中分離得到3種脂肪酸類化感物質(zhì):亞油酸、棕櫚酸和豆蔻酸,發(fā)現(xiàn)這 3種脂肪酸具有不同程度的抑藻作用,并將亞油酸作用于銅綠微囊藻進(jìn)行探求,證明其具有明顯的抑藻作用.鄭春艷等[20]認(rèn)為亞油酸、水楊酸和羥基苯甲酸對(duì)池塘水華混合藻類均有顯著的抑制作用,其中,亞油酸的抑制作用最強(qiáng).李玉瑛等[21]研究了鼠李糖脂對(duì) 5種赤潮藻類(塔瑪亞歷山大藻,赤潮異彎藻,雙突角毛藻,柔弱角毛藻和新月菱形藻)生長的影響,當(dāng) 15mg/L的鼠李糖脂加入到不同藻液中時(shí),會(huì)使這 5種藻細(xì)胞均遭到不可逆的破壞.Aliotta等[22]經(jīng)過研究認(rèn)為α-亞麻酸具有一定的抑藻活性,其抑藻活性主要來自于其氧化產(chǎn)物.從本研究可以看出,α-亞麻酸作用于赤潮異彎藻,其抑藻效果也相當(dāng)明顯.

2.2 α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞膜透性的影響

從圖3可以看出,α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻的細(xì)胞內(nèi)Na+、K+、Mg2+和Ca2+有不同程度的影響.對(duì)照組中細(xì)胞內(nèi)的Na+、K+、Mg2+和Ca2+在 0～36h內(nèi)變化不明顯,而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)金屬離子大量滲出.圖3A中,Na+濃度在12h開始下降,在36h下降明顯(P＜0.05);圖3B中,K+在4h開始下降,8h下降明顯(P＜0.05);Mg2+在4h就出現(xiàn)明顯下降,36h時(shí),實(shí)驗(yàn)組Mg2+和對(duì)照組差異顯著(P＜0.01);Ca2+在4h出現(xiàn)明顯下降,在36h時(shí)差異顯著(P＜0.01),說明加入α-亞麻酸后,細(xì)胞膜的透性明顯增加,細(xì)胞內(nèi)離子大量滲出,而在這4種離子中,Ca2+下降趨勢較明顯,這與 Ca2+作為膜的穩(wěn)定劑,在調(diào)節(jié)細(xì)胞膜透性方面起著重要的作用有關(guān).

細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放可以表征細(xì)胞膜的完整性[23].細(xì)胞膜是細(xì)胞的屏障,控制著細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)交換,具有選擇透性,能將細(xì)胞外的K+選擇性的轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi),而將細(xì)胞內(nèi)的Na+轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外.抑藻物質(zhì)能改變細(xì)胞膜的透性,造成細(xì)胞內(nèi)的Na+、K+、Mg2+和Ca2+外滲.在環(huán)境脅迫下,細(xì)胞膜被破壞,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含物滲出的研究已經(jīng)有許多報(bào)道.金屬離子、除草劑等有毒物質(zhì)能破壞斜生柵藻(Trebouxia erici)、小球藻(Chlorella sp.)等藻類的細(xì)胞膜[24-25].蘆葦化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)和普通小球藻(C. vulgaris)細(xì)胞膜透性具有不同程度的影響[26].在蘆葦化感物質(zhì)EMA的作用下,銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi) K+、Mg2+和Ca2+的滲出量約為對(duì)照組的1.5～2.0倍,說明EMA增加了離子的滲出量,破壞了細(xì)胞膜的滲透性.酚酸通過破壞銅綠微囊藻的細(xì)胞壁而起到抑制作用[27].所以,在本研究中,加入α-亞麻酸后,使赤潮異彎藻的細(xì)胞壁受到一定的破壞,細(xì)胞膜的通透性增加,細(xì)胞內(nèi)的離子外滲,導(dǎo)致藻的生長受到抑制.

圖3 α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻Na+、K+、Mg2+和Ca2+滲出率的影響Fig.3 The effects of α-linolenic acid on the efflux of Na+、K+、 Mg2+ and Ca2+ of H. akashiwo

2.3 α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞抗氧化酶系的影響

生物在長期的進(jìn)化過程中,為了防止體內(nèi)過多活性氧對(duì)機(jī)體的傷害,形成了一套有效的抗氧化防御系統(tǒng).SOD、POD、CAT是植物體內(nèi)的重要保護(hù)酶,在清除自由基過程中起著重要的作用.所以,在外環(huán)境的刺激下,細(xì)胞內(nèi)的酶活強(qiáng)弱直接關(guān)系到抵抗環(huán)境傷害的能力.在正常條件下,細(xì)胞內(nèi)活性氧(O2-)的產(chǎn)生和分解之間處于一種平衡狀態(tài),使 O2-等自由基處于適宜的水平.SOD在清除自由基中起重要作用,對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用,此酶能清除超氧陰離子自由基(O2-),保護(hù)細(xì)胞免受損失,SOD活性的高低與植物的抗逆性有一定的相關(guān)性[28].

國內(nèi)外的研究顯示,植物化感物質(zhì)可能的抑藻機(jī)理為破壞葉綠素,破壞細(xì)胞膜,影響某些酶的活性.藻細(xì)胞在受到外界刺激時(shí),抗氧化系統(tǒng)會(huì)有應(yīng)激性的反應(yīng).久效磷、Cd等脅迫都可能對(duì)微藻細(xì)胞的抗氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行破壞,使SOD、POD活性降低,MDA 含量升高[29-30].唐萍等[31]發(fā)現(xiàn)鳳眼蓮能使柵藻(Scenedesmus arcuatus)藻體黃化,葉綠體、線粒體、類囊體、細(xì)胞壁等細(xì)胞器受到損傷,藻細(xì)胞可溶性蛋白含量直線下降,SOD和POD活性先升高后下降,MDA含量則上升.

從表1可以看出,加入α-亞麻酸后,赤潮異彎藻的蛋白質(zhì)含量較穩(wěn)定,24h后,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較出現(xiàn)一定的下降.實(shí)驗(yàn)組 SOD、POD、CAT和MDA活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,4h時(shí),實(shí)驗(yàn)組的CAT活性明顯高于對(duì)照(P＜0.01),隨后迅速下降,8h時(shí)明顯低于對(duì)照組(P＜0.001);SOD和POD則在 8h時(shí)明顯高于對(duì)照組,其后逐漸下降;CAT和MDA逐漸增加,在 12h達(dá)到最高值.SOD的主要功能是清除O2-,O2-可被SOD歧化,產(chǎn)生 H2O2,它可與 O2-相互作用產(chǎn)生更多的自由基OH,OH-和O2-,而OH-毒性極大,引起膜脂過氧化作用.在生物體內(nèi),O2-是通過SOD歧化分解的,H2O2通過CAT和POD氧化分解.所以,它們?nèi)呤菂f(xié)同作用,使生物體內(nèi)的自由基維持在一個(gè)低的水平.MDA是生物膜系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一,其濃度表征了脂質(zhì)過氧化強(qiáng)度和膜系統(tǒng)受傷害程度.本實(shí)驗(yàn)中MDA逐漸上升表明,隨著接觸時(shí)間的增加,SOD活性的下降,活性氧的產(chǎn)生和清除之間的平衡被破壞,細(xì)胞的膜脂質(zhì)過氧化程度加劇,細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到破壞.隨著藻細(xì)胞的部分死亡,藻體分解,藻細(xì)胞內(nèi)的MDA也隨著消失,故在36h出現(xiàn)下降的趨勢.

表1 α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻的可溶性蛋白、CAT、SOD、POD和MDA的影響Table 1 The effects of α-linolenic acid on the soluble protein, CAT, SOD, POA, MDA content of H. akashiwo

2.4 α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻光合放氧量的影響

圖4 α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻光合放氧量的影響Fig.4 The effects of α-linolenic acid on the photosynthetic oxygen of H. akashiwo

從圖4可以看出,隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,對(duì)照組的光合放氧量變化不顯著,而α-亞麻酸處理組的光合放氧量則逐漸減少,出現(xiàn)顯著的變化.這表明赤潮異彎藻細(xì)胞內(nèi)的光合酶系如 RuBP羧化酶、PEP羧化酶、葉綠體反應(yīng)、光系統(tǒng)活力等受到了一定程度的影響[32],從而導(dǎo)致藻細(xì)胞的光合作用受到抑制,生長速率下降.

3 結(jié)語

α-亞麻酸對(duì)赤潮異彎藻具有一定的生長抑制作用,其抑制機(jī)理可能是先破壞藻細(xì)胞膜的通透性,以改變細(xì)胞內(nèi)金屬離子的滲出率.同時(shí),細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系活性降低,藻細(xì)胞的光合放氧量明顯下降,最終表現(xiàn)為赤潮異彎藻生長受到抑制.

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