一株羅伊氏乳桿菌的生物學特性研究

邵景海，楊郁葒，李亮，韓迪，趙霞，方曙光

（1.完達山乳業股份有限公司，哈爾濱 150000；2.潤盈生物工程（上海）有限公司，上海 710021）

一株羅伊氏乳桿菌的生物學特性研究

邵景海1，楊郁葒1，李亮2，韓迪2，趙霞2，方曙光2

（1.完達山乳業股份有限公司，哈爾濱 150000；2.潤盈生物工程（上海）有限公司，上海 710021）

研究了一株完達山乳業和潤盈生物菌種研究項目組分離的羅伊氏乳桿菌LR-G100的耐胃酸、耐膽鹽、降膽固醇和抑制腸道有害菌的生物學特性。結果表明，羅伊氏乳桿菌在pH值為2.5～4.5條件下，具有較強的生存能力；在膽鹽質量分數為0.1%～0.5%環境中，活菌數能保持在106mL-1以上；在反應16 h后，同化膽固醇百分率能達到50%以上；對腸道有害菌的抑制效果也非常顯著。

羅伊氏乳桿菌；生物學特性；降膽固醇；抑菌

0 引言

羅伊氏乳桿菌是益生菌中具有代表性的典型菌屬，具有降膽固醇，改善和調節腸道菌群平衡，提高機體免疫力的功能[1]。本實驗菌株羅伊氏乳桿菌LRG100，完達山乳業和潤盈生物菌種研究項目組分離篩選自高加索自然發酵的酸奶中。研究表明，益生菌能發揮保健功能，前提條件之一，是到達人體腸道的活菌數應在106cfu/mL以上[2]。人體胃腸為高酸、高膽鹽環境，羅伊氏乳桿菌進入人體后，能否順利通過胃腸道環境，是決定其發揮保健功能的關鍵因素所在。本實驗研究了羅伊氏乳桿菌LR-G100的生長特性，對胃酸、膽鹽的耐受性，降膽固醇特性以及抑菌特性，以期為羅伊氏乳桿菌的益生作用提供理論依據，進而為其保健功能的的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：羅伊氏乳桿菌（編號為LR-G100），此菌株分離于長壽地區高加索山脈的酸奶，菌株編號為LR-G100，經中國科學院微生物研究所鑒定為羅伊氏乳桿菌。

培養基：MRS培養基，營養瓊脂培養基，Skirrow氏培養基等，121℃滅菌20 min。

主要儀器：DHP-9082型培養箱，WFZ UV-2102型紫外可見分光光度計，LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，蘇州佳寶JB-VS-1300U型潔凈工作臺等。

1.2 方法

（1）菌株鑒定。經過生理生化初步確定后，再經過16s RNA提取擴增測序，并在NCBI比對，做菌種鑒定。

（2）產酸和生長動力學。將LR-G100活化18 h后，采用2%接種量，接種于12%全脂奶粉復原乳中，37℃恒溫培養，在培養的第0～18 h內，每隔1 h取樣，測酸度及活菌數。采用0.l mol/L的氫氧化鈉溶液滴定酸度(oT)，活菌計數采用傾注平板計數法[3]。

（3）耐酸測試。用濃度為0.1 mol/L的HCl將MRS液體培養基pH值，分別調為1.5，2.5，3.5，4.5；115℃滅菌15 min，冷卻，無菌條件下接種質量分數為2%的LR-G100種子液，于37℃恒溫培養，在培養的0～6 h內每隔1 h取樣計活菌數。

（4）耐膽鹽實驗。用豬膽汁鹽將MRS液體培養基的膽汁鹽質量分數，分別調為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%；115℃滅菌15 min，冷卻，無菌條件下接種2%的LRG100種子液，于37℃恒溫培養，在培養的0～5 h內每隔1 h取樣計活菌數。

（5）同化膽固醇能力測定。采用比色法來測定LR-G100對膽固醇的同化效果[4]。

（6）抑制胃腸致病菌測定。采用單層瓊脂擴散法[5]，測定LR-G100對大腸桿菌和幽門螺旋桿菌的抑菌效果，以抑菌圈直徑作為抑菌效果的指標。

2 結果與分析

2.1 羅伊氏乳桿菌16sRNA鑒定

經過16sRNA提取擴增測序，并在NCBI做序列比對后，鑒定為羅伊氏乳桿菌，具體序列如下：

2.2 產酸和生長動力學測定

在質量分數為12%全脂奶粉復原乳中，接入質量分數為2%的LR-G100種子液，于37℃恒溫培養，其產酸和活菌數變化如圖1和圖2所示。由圖2和圖3可以看出，發酵10 h時，發酵復原乳酸度達到67oT，活菌數維持在3.1×108mL-1的水平。

2.3 耐酸性能測定

LR-G100在不同pH值的滅菌MRS液體培養基中,活菌數變化如表1所示。由表1可以看出，在pH值為4.5條件下，LR-G100活菌數呈現增加趨勢，即使在pH值為2.5條件下，4 h的活菌數仍達到106mL-1，而在pH值為1.5以下，經過4 h培養后大部分羅伊氏乳桿菌死亡，但在培養2 h后的活菌數仍能達到105mL-1，表明LR-G100耐酸性極優，可通過胃的強酸環境。

表1 LR-G100在不同pH值條件下的活菌數變化狀況

2.4 耐膽鹽性能測定

LR-G100在不同膽鹽濃度的滅菌MRS液體培養基中,活菌數變化如圖3所示，雖然在0.4%膽鹽培養基中培養2 h時LR-G100活菌數有所下降，但6 h后仍能維持在106mL-1以上，這表明LR-G100在0.1%～0.4%膽鹽質量分數下耐受性極優。也說明LR-G100能夠通過小腸到達大腸，可以充分發揮其益生作用。

2.5 同化膽固醇能力測定

通過測定羅伊氏乳桿菌發酵乳中,膽固醇的吸光度的變化，可以確定LR-G100對膽固醇的同化效果，結果如表2所示。由表2可以看出，LR-G100在16 h對膽固醇的同化率達到50%以上，且同化率隨著時間延長呈上升趨勢，這說明LR-G100有較好的同化膽固醇的能力。

表2 LR-G100同化膽固醇的能力

2.6 對胃腸致病菌的抑制作用測定

平板抑菌實驗顯示，LR-G100對大腸桿菌的抑菌圈直徑都在11 mm以上，平均在11.5 mm(見圖4)，大于一般乳酸菌對大腸桿菌的抑制圈直徑（7～10 mm）；LR-G100對幽門螺旋桿菌的抑菌圈直徑在10 mm以上，平均在11.5 mm(見圖5)，大于一般的乳酸菌對幽門螺旋桿菌的抑制圈直徑（5～7 mm），此結果表明，LRG100能有效地抑制或殺死大腸桿菌和幽門螺旋桿菌。

3 結論

綜上所述，從俄羅斯高加索地區自然發酵酸奶樣中，分離和鑒定出的一株羅伊氏乳桿菌LR-G100，具有優良的益生菌生物學特性，在模擬胃腸環境條件下，具有較強的耐酸、耐膽鹽能力，絕大多數能通過腸胃到達腸道，降解膽固醇效果明顯，并能抑制有害菌，起到調節腸道菌群的作用，可適合添加于功能型益生菌酸奶或發酵乳飲品中。在瑞士和日本，羅伊氏乳桿菌已經在許多功能性食品中得到應用。隨著國內對羅伊氏乳桿菌研究的不斷深入，該菌在乳制品行業，以及食品行業的應用領域和使用方法也會不斷擴大，這也是我國益生菌產業的發展趨勢和必然結果。

[1]龐潔,周娜,劉鵬,等.羅伊氏乳桿菌的益生功能[J].中國生物工程雜志,2011,31(5):131-137.

[2]GISMONDO M R,DRAGO L,LOMBARDY A.Review of Probiotics Available to Modify Gastrointestinal Flora[J].International Journal of Antimicrobial Agents,1999,12:287-292.

[3]楊潔彬,興華,代文.乳酸菌—生物學基礎及應用[M].北京:中國輕工業出版社,1991:1-3.

[4]趙瑞香,孫俊良,李明靜,等.嗜酸乳桿菌同化MRS培養基中膽固醇能力的研究[J].Chinese Journal of Micro ecology,2005,17(8):254-255.

[5]李正華.羅伊氏乳桿菌生物學特性及功能性發酵乳的研究[D].無錫:江南大學,2003.

Phenotype investigation on a strain of lactobacillus reuteri

SHAO Jing-hai1，YANG Yu-hong1，LI Liang2，HAN Di2，ZHAO Xiao2，FANG Shu-guang2
（1.Wondersun Dairy Company,Harbin 150000，China；2.BioGrowing Co.Ltd.,Shanghai 710021，China）

The phenotype characteristics:survivability to gastric acid and bile salt,capacity of cholesterol assimilation,and anti-microbial effect to pathogenic bacteria,of a strain ofLactobacillus reuteriLR-G100,were investigated.The result shows that this strain has strong survivability under pH 2.5～4.5,and the vial cell number maintains above 106cfu/mL even when bile salt concentration is 0.1%～0.5%.This strain has distinct anti-microbial effect to enteropathogenic bacteria,and the capacity(%)of cholesterol assimilation could reach 50%after 16 hrs of reaction.

Lactobacillus reuteri；phenotype characteristics；cholesterol assimilation；anti-microbial

Q936

A

1001-2230（2012）03-0028-03

2012-01-20

邵景海（1975-），男，食品高級工程師，研究方向為乳制品加工。