海灣扇貝與紫扇貝生殖隔離研究

張守都, 張國范, 李 莉

(1．中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2．中國科學院 研究生院, 北京 100049)

海灣扇貝與紫扇貝生殖隔離研究

張守都1,2, 張國范1, 李 莉1

(1．中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2．中國科學院 研究生院, 北京 100049)

對海灣扇貝(Argopecten irradians)和秘魯紫扇貝(Argopecten purpuratus)進行了跨種間的雜交嘗試, 結果顯示兩個物種之間正向和反向均可受精和正常發育, 沒有發現合子前隔離, 并且通過 internal transcribed spacer 1(ITS1)標記驗證了雜交的成功。至雜交子一代性成熟時通過對雜合子成熟性腺進行H.E.染色石蠟切片觀察發現, 雄性性腺明顯退化且不能產生有活力的精子, 雌性性腺發達且能形成外觀正常卵子, 但是卻不能與親本進行回交, 即表現為典型的合子后隔離： 雜種不育。

海灣扇貝(Argopecten irradians); 秘魯紫扇貝(Argopecten purpuratus); 種間雜交; ITS1; 合子后隔離

物種的形成一般認為是一個新的物種從一個單一的種系逐漸分化出來的結果, 而相對的另外一種方式則是由雜交引起的新物種的形成, 即由兩個截然不同的物種系通過雜交的方式同時對新的物種產生遺傳物質上的貢獻[1]。這種雜交即是指遠緣雜交,根據雜交物種之間的進化距離又分為種間雜交、屬間雜交、科間雜交以及更高分類階元之間的雜交?，F代物種的定義中很重要的一個屬性就是生殖隔離,生殖隔離是各個物種在自然界中能夠獨立而且穩定存在的關鍵因素。所以遠緣雜交首先要克服這種不同物種間的生殖隔離機制, 而事實證明無論在自然界中的天然雜交種還是人工干預的遠緣雜交均具有這種潛力。在自然界中大約有 10%的動物和 25%的植物至少和一個其他的物種發生過雜交, 遠緣雜交是基因組進化和物種形成的主要動力之一[2]。很多生物學家近年也在通過人工控制研究在地理分布上有重疊區的近緣物種之間的遠緣雜交來模擬在新的物種形成的過程[1], 進一步揭示了遠緣雜交在物種形成中的普遍性和現實中的可操作性。

遠緣雜交目前已經成為作物品種改良和新品種開發的重要手段, 在水稻、小麥、玉米、花椒、番茄、大豆、棉花等很多作物品種的育種中通過遠緣雜交獲取雄性不育系進而對雜種優勢的利用獲得了巨大的成效。目前在動物育種中的相關研究還比較少, 主要原因之一是受生物物種生殖隔離機制的影響遠緣雜交難以獲得成功, 包括難以獲得雜交種和雜種后代難以延續, 一個典型案例就是馬和驢雜交獲得騾子, 但是騾子卻不能生育; 二是獲得雜種的后代分離難以控制, 世代長, 穩定慢。海灣扇貝(Argopecten irradians)自 1982年被引入中國以后在中國北方大規模推廣養殖, 形成了一個成功的新品種產業。但由于多年的小規模的群體內繁育導致國內海灣扇貝養殖群體近交衰退嚴重[3], 現有品種資源已無法滿足日新月異的育種目標要求, 海灣扇貝育種工作要取得突破, 必須借助于更加廣泛的遺傳資源的利用, 遠緣雜交可以打破品種間的界限, 擴大基因重組的范圍, 獲得更加豐富的變異類型。秘魯紫扇貝(Argopecten purpuratus)與海灣扇貝同屬, 染色體均為 32條[4], 具備進行遠緣雜交成功和產生新物種的可能性。真核生物的rDNA中的ITS1區域相比其他區域進化要快的多, 與其相鄰的18S rRNA則表現出高度的保守性, 能方便的設計通用引物, 從而能實現以相同的引物在不同物種間進行擴增達到物種鑒定的目的[5]。本研究通過ITS1擴增片段分析驗證了這兩種扇貝之間的雜交并對在遠緣雜交中產生的生殖隔離問題進行初步的探討。

1 材料與方法

1.1 親貝的獲取和培養

實驗所用的海灣扇貝(以下簡稱 C)和智利紫扇貝(以下簡稱 P)由大連壹橋苗業集團有限公司提供,海灣扇貝于2009年4月選自大連壹橋苗業集團有限公司育苗車間的生產所用親貝, 智利紫扇貝為 2009年從秘魯引進。所有實驗用親貝均同時在大連壹橋苗業集團有限公司育苗車間培育, 進行性腺促熟,整個促熟過程遵循無公害食品海灣扇貝養殖技術規范NY／T 5063-2001。

1.2 產卵和受精

從每個群體中隨機挑選 10只性腺發育至第四期[6]的個體在空氣中陰干 30 min, 然后對每只扇貝注射五羥色胺[7], 將每一個準備好的扇貝逐一放入一個單獨容器中待產, 所處理扇貝會首先排放精子,收集質量好的精子備用, 接下來中間會出現一個暫停期, 將扇貝用新鮮海水沖洗幾遍后放回燒杯中,待其進一步排放卵子。為了進一步防止自體受精, 每次收集卵子均進行洗卵, 然后收集在顯微鏡下檢查過的未被污染的卵子備用。

精子和卵收集完成后, 開始授精。首先將一個群體(紫扇貝或海灣扇貝)各扇貝的部分精子混合, 然后同另一個群體10個扇貝的部分卵進行授精, 形成兩個群體的正反交組合(紫扇貝(♀)×海灣扇貝(♂),海灣扇貝(♂)×紫扇貝(♀))。然后, 進行群體內交配(紫扇貝×紫扇貝,海灣扇貝×海灣扇貝), 將每個群體的10個扇貝分為兩組, 每組5個, 將其中5個扇貝的精子與另外 5個扇貝的卵授精, 反之亦然。因此,得到4個交配組合(紫扇貝×紫扇貝, 紫扇貝(♀)×海灣扇貝(♂),海灣扇貝(♂)×紫扇貝(♀)和海灣扇貝×海灣扇貝)。實驗設3個重復組。

1.3 雜交子一代的分子確定

1.3.1 DNA的提取

用天根生化科技有限公司的Fast200 DNA 提取試劑盒參照廠家說明書提取實驗用親本和雜交子一代的DNA。

1.3.2 ITS1序列的克隆和測序

ITS1序列的引物參照喻子牛[8]：5′GGTTTCTGTAGGTGACCTGC3′(18S正向)和5′CTGCGTTCTTCATCGACCC3′(5.8S 反向)。PCR 反應體系為： 1.5 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTP, 0.2μmmol/L 每對引物, 20 ng DNA模版, 1 U Taq polymerase, 2.5 μL10× PCR buffer, 以及 0.4 mg/mL BSA。PCR反應程序為： 95oC 5 min, 30個循環中95oC變性 1 min, 55oC 退火 1 min, 72oC 延伸 1 min, 最后72oC大延伸5 min。所有PCR反應均在TAKARA的TP600 PCR儀上進行。親本擴增片段直接送交北京華大公司進行測序并進行序列比對查找物種特異位點。雜交子一代擴增序列經在濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上分型, 并用Axygen公司AxyPrepTM DNA回收試劑盒進行目標片段的回收, 用天根生化科技有限公司的pEASY-T1克隆試劑盒和Trans1-T1感受態細胞將回收的目標片段進行克隆, 通過菌落 PCR檢測克隆的成功性, 將陽性克隆送交北京華大公司測序, 每個個體隨機測6個單倍型克隆。

1.4 雜交子一代回交研究

由于正反雜交子一代均只能產生卵子, 所以回交是以親本的精子和子代的卵子進行的, 為避免雜交子一代中可能會有隱性精子的污染, 亦對卵子進行嚴格的洗卵, 方法同上。

1.5 雜交子一代性腺的組織學切片觀察

對海灣扇貝和紫扇貝×海灣扇貝雜交子一代的成熟性腺取樣進行 H.E.染色石蠟包埋切片, 方法參考任成林等[9], 并對雜交子一代性腺發育的異常同正常海灣扇貝成熟性腺進行對比分析。

1.6 數據分析

各實驗組的數據比較用 One—Way ANOVA方差分析, 采用統計分析軟件SPSS 17．0, 差異顯著性設為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 兩種扇貝雜交時的受精觀察

本實驗結果顯示, 海灣扇貝同秘魯紫扇貝的雙列雜交正反交過程中均可受精并能正常孵化, 正反雜交組合的受精率和孵化率同純種對照組并無顯著差異(P＞0.05, 表 1）。

2.2 雜交子一代的分子鑒定

經過對兩種扇貝親本的 ITS1序列的比對分析,發現了 8個物種特異的標記位點。以此為標記確定了在隨機測的紫扇貝(♀)×海灣扇貝(♂)雜交組和海灣扇貝(♂)×紫扇貝(♀)雜交組的雜合子個體中的單倍型克隆中均含有來自兩個物種的序列, 進而確定了雜交的可信性(圖 1： 來源于紫扇貝(♀)×海灣扇貝(♂)雜交組的雜合子同父母本的ITS1序列比對分析, 海灣扇貝(♂)×紫扇貝(♀)組結果相同此處未列出)。

表1 4個實驗組的受精率和孵化率的比較Tab. 1 Comparation of fertilization rate and hatching rate between four experimental groups (mean +SD)

圖1 親本(c4：海灣扇貝, p5：秘魯紫扇貝)和一個隨機抽取PC組雜合子的ITS1序列(z35,z36)的比對結果Fig. 1 Comparation of four ITS1 sequences： c4 from Argopecten irradians parent; p5 from Argopecten purpuratus parent; and z35 and z36 from one random PC hybrid individual

2.3 雜合子與親本的回交

海灣扇貝同秘魯扇貝的雜合子與親本的回交已經有報道[10], 本研究中正反雜交雜合子可成功生長至性成熟(圖 2-1), 人工促熟方法同前。雜合子性腺成熟過程中前期同海灣扇貝并無太大差異, 既表現為性腺外表生長一層黑膜, 隨著性腺的成熟黑膜逐漸褪去, 此時性腺表觀同性腺成熟海灣扇貝相似,為精區和卵區區分明顯的雌雄同體, 但不能進行人工采卵, 可能性腺未能達到真正成熟。當繼續進行促熟時, 性腺開始逐漸發生單雌性化轉變, 轉變比例最大可達90.9%, 并且能成功采出成熟的卵子, 未見有成熟精子排出。作者通過解剖的方式觀察部分殘留的雄性性腺部分, 發現雄性性腺發育異常, 未見有成型精子或者精原細胞生成, 即雜合子表現為雄性敗育, 只有成熟的卵子可以排出, 所以作者實施的回交是以正反交兩個組別雜合子的卵子和海灣扇貝的精子進行的, 受精觀察發現, 每組回交受精率低于 20%, 受精的卵子發育緩慢, 在 24 h之后發育到囊胚期, 且停滯在這個階段直至死亡, 即正反交組別的雜合子均表現為同親本的完全生殖隔離。

2.4 雜合子性成熟性腺的組織切片觀察

通過 H.E.染色石蠟包埋切片對紫扇貝×海灣扇貝組別雜合子的表觀為全雌化的性腺進行切片觀察(圖2-5、圖2-6)并同正常海灣扇貝的性腺切片(圖2-3、圖 2-4)進行對比, 結果發現紫扇貝×海灣扇貝組別雜合子扇貝性腺同海灣扇貝性腺相比雌性性腺發達而雄性性腺幾乎退化消失, 同其外表型結果相一致(圖2-1), 即雄性敗育, 但由于回交的障礙尚不能確定雜合子產生的卵子是否正常。

圖2 雜合子成熟性腺及其組織切片Fig. 2 Mature gonad and tissue slice of the Hybrid

3 討論

生殖隔離是近代關于物種定義的核心[11],但它在物種形成和保持物種穩定方面的作用其實要比它對物種的定義影響大得多[2]。生殖隔離分為合子前隔離和合子后隔離, 合子前隔離又分為行為性隔離, 形態及機械隔離, 配子不親和等; 合子后隔離包括雜種不活或弱勢, 雜種不育, 雜種衰敗等。自然界中存在的天然雜種, 特別是研究兩個同域分布物種之間存在的雜交帶, 逐漸成為近年來植物系統與進化領域的熱點領域, 因為這為探討生殖隔離在物種起源方式及物種進化模式提供了很好的素材。在天然雜種中的生殖隔離也是多種多樣的, Zachariah 等[11]發現Lycaeides melissa和Lycaeides idas這兩種蝴蝶在自然界中的雜交種同親本的隔離方式主要是與宿主植物相關行為和生態適應性相關的, 所以決定個體行為的尤其是交配行為的個體形態上的差別以及雜交種對一些極端的或者全新的生態環境的習慣會導致雜交種同其親本甚至是雜交種之間的生殖隔離。Jesu′s等[1]研究也發現基于外表形態的強烈的選擇性交配以及地理環境的分化是造成H.melpomene和H.cydno同其雜交種H.heurippa生殖隔離的主要原因。而跨種雜種合子后隔離在人們的生活中則是更加普遍, 像驢和馬的雜交產生騾子, 老虎和獅子雜交產生虎獅獸等, 無論是合子前隔離還是合子后隔離都傾向于雜種后代適合度的下降, 這與自然選擇傾向于淘汰雜交種來確保物種的獨立性是相一致的。但是當雜合子偶然碰上適合它的生態位的時候,生殖隔離機制可能會消失或者部分消失而導致一個新物種的可能形成, 所以從某種意義上說生殖隔離是物種在進化中的一個重要動力。

生殖隔離的克服是遠緣雜交在人工育種中應用的關鍵, 而合子后隔離是作者在人工育種中遇到的主要的隔離方式, 遠緣雜交后代一般表現為高度不育, 因為在雜種的體細胞中沒有同源染色體, 減數分裂過程中染色體聯會和分離就會發生紊亂, 從而得不到功能正常的生殖細胞。但如果雜種染色體數目自然加倍成異源多倍體, 其細胞內染色體就能正常配對, 最終發育成可育的配子。這種異源多倍體一旦出現會立即導致基因流的阻斷并形成繁殖隔離[12],成為一個新的物種。基于以上的理論基礎, 遠緣雜交已經在農作物的育種中取得了巨大的成果, 無論是對作物品種遺傳資源的改良還是通過遠緣雜交培育雄性不育系來對雜種優勢的利用都給農作物的育種打開了一個全新的視野[13]。到目前動物育種中對遠緣雜交的利用跟植物相比還處于初級階段, 目前國內見報道較多的是魚類的育種, 但是魚類育種有一個很大的優勢是很多的雜種一代是可育的, 對育種的遺傳資源可以很快得到拓展, 對育種的效果立竿見影[14]。在貝類育種中相關報道還比較少見, Zhang等[15]進行了海灣扇貝北方亞種和南方亞種墨西哥灣貝的亞種間雜交, 未見有種間隔離的現象, 但這并不算是真正的種間雜交。本研究首先通過 ITS分子標記確認了雜交后代為真實的雜合子, 即這兩種扇貝在雜交時并不存在生殖隔離, 雙向受精均可實現,并能正常孵化和生長至成體, 并沒有出現合子前生殖隔離。但雜合子一代卻表現為典型的合子后生殖隔離： 雜合子不育。導致這種遠緣雜交不相容的原因大致可分為三點： 第一, 親本雙方染色體的數目或核型差別過大。染色體數目不同導致基因組數目和性質的差異, 從而引起雜合個體中來源于父母雙方的等位基因不協調, 引起代謝紊亂, 導致雜合個體不發育甚至死亡。第二, 酶的基因座位或表達的時空順序的差異。雜交親本的親緣關系越遠, 雙親的等位基因表達的時空順序可能不同步或出現相互抑制。酶的不相容性就會導致雜種胚胎組織的誘導和器官形成時空失調, 于是產生畸形或中途死亡。第三, 核質不相容。研究表明, 母體卵細胞質控制雜種胚胎基因表達的遲滯或加速。如果卵子的細胞質不能與精子的核 DNA正常協調(不相容), 就會阻滯或加速基因的表達, 從而致使胚胎不能正常發育, 直至死亡[14]。根據本研究的實驗結果, 雜合子可正常發育(至少是外觀發育正常)至性成熟, 而實驗中所用父母本染色體數目均為 32條[4], 這說明父母雙方的并未因染色體數目的差異而引起代謝紊亂而影響到個體的存活和發育。但雜合子個體在性成熟后并不能產生可育的配子, 這可能與這兩種扇貝的染色體核型的明顯差異[4]有關, 在配子形成過程中進行減數分裂前期, 來源于父母本雙方的染色體雖然數目一樣, 但由于核型上的差異, 染色體的性質并不相同,導致同源染色體聯會時不能正確配對, 從而不能產生正常的配子, 這是導致本研究中雜合子不育的主要原因。另外根據雜合子性腺成熟后期外觀上出現的由雌雄同體向全雌化轉變現象, 作者推測導致雙親間等位基因表達發生紊亂, 由酶的不相容性導致了這種器官發育的時空失調。而鑒于正反雜交的差異性并不不顯著, 在本研究中沒有表現出明顯的核質不相容現象。雜合子不育給這兩種扇貝間的雜交在扇貝育種的后續運用帶來了困難, 由于父母本都是雌雄同體, 在排放精卵時很容易自體受精, 影響到雜交效果。而生產中又因成本和可操作性不能按本研究中精卵分離方法進行精確雜交, 這就很大程度上限制了該雜交在生產中的大規模推廣, 而雜合子后代由于不育并不能作為品種選育的基礎。針對這種問題, 目前做的只能是充分利用扇貝的高繁殖力, 即一次能產生大量的配子, 通過回交的手段來獲取減數分裂時能正常聯會分離的個體, 進行可育性的漸進選擇從而改變其育性, 但這可能是一個漫長而艱難的過程。隨著貝類研究進入基因組時代和各種新的分子生物技術的出現, 相信通過分子生物學的方法來闡明和克服這種種間隔離機制在不遠的將來一定會實現, 到那時貝類的遺傳育種工作一定會開拓出一片新天地。

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Reproductive isolation of inter-specific crosses betweenArgopecten irradiansandArgopecten purpuratus

ZHANG Shou-du1,2, ZHANG Guo-fan1, LI Li1
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Nov.,21,2011

Argopecten irradians;Argopecten purpuratus; inter-specific crosses; ITS1; reproductive isolation

Inter-specific crosses were conducted betweenArgopecten irradiansandArgopecten purpuratus.Bidirectional fertilizations and successful hatching were examined for all crosses and no prezygotic isolation was observed. The success of hybridization was confirmed by ITS1 maker. Through the observation of H. E. staining paraffin slice of the gonad of mature hybrids , male gonad was found obsolescence without any active sperm while female gonad was developed with abundant normal appearance eggs. But the hybrids eggs could not back-cross with the parental species, exhibiting typical postzygotic isolation—hybrid sterile.

S917.3

A

1000-3096(2012)08-0009-06

2011-11-21;

2012-03-06

國家“863”項目(2006AA10A408, 2010AA10A401); 國家公益性行業(農業)科研專項(3-35)

張守都(1984-), 男, 山東日照人, 博士研究生, 主要從事水產研究, 電話： 053282898712, E-mail： shouduzhang@163.com; 李莉,通信作者, E-mail： lili@qdio.ac.cn

致謝：感謝大連壹橋苗業有限公司為本研究提供了紫扇貝和海灣扇貝親本材料、實驗所用的場地以及所有設施并負責子代的培養, 青島農業大學王春德博士具體負責紫扇貝的引種工作, 一并致謝！感謝中國科學院海洋所何滔博士在組織切片中提供的幫助！

梁德海)