白術對慢傳輸型便秘大鼠結腸組織Cajal間質細胞的影響*

孟 萍，尹建康，高曉靜，劉 平，王 凡，王 靜

(江西中醫藥高等專科學校，江西撫州 344000)

白術對慢傳輸型便秘大鼠結腸組織Cajal間質細胞的影響*

孟 萍，尹建康，高曉靜，劉 平，王 凡，王 靜

(江西中醫藥高等專科學校，江西撫州 344000)

目的：運用免疫組化方法檢測白術對慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)大鼠結腸組織Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)的影響，進一步闡釋白術治療STC的機制。方法：隨機將成年健康SD大鼠60只分為空白對照組、模型對照組、白術低劑量組(30 g生藥/kg)、白術中劑量組(60 g生藥/kg)、白術高劑量組(120 g生藥/kg)，每組12只。應用大黃對除空白對照組以外的大鼠進行慢傳輸型便秘模型制備。造模成功后，空白及模型對照組給予生理鹽水2 mL灌胃，白術低、中、高劑量組分別給予3 g生藥/mL、6 g生藥/mL、12 g生藥/mL的白術水煎液2 mL，早晚2次，連續15 d。15 d中連續觀察大鼠皮毛光澤、活動范圍、進食量及排便情況。末次給藥后用免疫組化法觀察結腸ICC的形態和數量。結果：模型對照組大鼠結腸較其他各組粗大、迂曲，腸腔內有較大塊較多粒糞便存留，差別有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。各組大鼠在給藥前體質量差別均無統計學意義(P＞0.05)，而處死前各組大鼠體質量差別均有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。c-kit免疫組化法染色半定量分析，各組差別有統計學意義(P＜0.05)。400倍光鏡下白術低劑量組、白術中劑量組鏡下所見與空白對照組相似，區別不大，ICC數量差異不大;而模型對照組及白術高劑量組ICC均有所改變，形態出現異常，體積變小，核周胞漿突起變鈍、變短，ICC數量差異較大，差別有統計學意義(P＜0.01)。結論：白術可以改善結腸組織中 ICC形態并提高ICC數量，劑量60 g的生白術能將上述效應發揮最好。

白術/藥效學;慢傳輸型便秘/藥物作用;Cajal間質細胞

慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)是指由于各種原因造成的結腸運動功能遲緩，傳輸糞便功能下降而導致的便秘，于1986年被首次提出，臨床上以結腸通過時間延長和對纖維素、緩瀉劑治療反應差為特征。Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是胃腸道神經系統的一種非神經但又與神經密切相關的特殊間質細胞。研究表明：ICC可能是腸道慢波的起搏者，有潛在的控制胃腸道動力的作用。ICC減少在STC患者結腸動力障礙的發生機制中起到非常關鍵的作用［1］。白術一向被看作“健脾燥濕藥”，具有止瀉作用;但《傷寒論》第174條曰“傷寒八九日……其人大便硬，小便自利者，去桂加白術湯主之”，且白術用量為 4兩(120 g)，為后世醫家疑之。1978年魏龍驤老中醫介紹大劑量白術治療便秘有效［2］，始引起學者重視。本研究運用免疫組化及鏡檢檢測不同劑量的白術水煎液對STC大鼠結腸組織ICC的影響旨在從微觀進一步闡釋白術治療STC的機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SD大鼠60只，雌雄各半，清潔級，體質量120～150 g，由江西中醫學院實驗動物管理中心提供，許可證號為SCXK(贛)2005－0001，動物質量合格證號為JZDW2009－0309，由江西中醫藥高等專科學校實驗動物管理中心飼養。

1.2 藥品與試劑

白術與1000 g大黃粉均由江西中醫藥高等專科學校附屬醫院中藥房提供，其中白術被制成低、中、高3種劑量水煎液，分別為30，60，120 g生藥/kg。兔多抗c-kit抗體(一抗)，Santa Cruz公司產品，批號09011222;兔/鼠兩步法試劑盒(二抗)，北京中杉金橋生物技術有限公司產品，批號09032105;DBA顯色液，北京中杉金橋生物技術有限公司產品，批號08112302。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

隨機將60只大鼠分為空白對照組、模型對照組、白術低劑量組(30 g生藥/kg)、白術中劑量組(60 g生藥/kg)及白術高劑量組(120 g生藥/kg)，每組12只。除空白對照組大鼠灌胃生理鹽水外，其余大鼠灌胃含大黃粉懸液以建立模型。大黃的用量開始時為0.6 mg/(g·d)，以后每日在前日的基礎上加倍，直到出現半數致瀉，再保持此劑量到80%小鼠稀便消失，然后在此基礎上加倍給藥，又有近半數大鼠出現腹瀉。如此循環3次，待最后80%小鼠稀便消失1周后停藥，以誘導實驗性STC大鼠模型。成功造模后，空白對照及模型對照組給予生理鹽水2 mL灌胃，白術低、中、高劑量組分別給予3，6，12 g生藥/mL的白術水煎液2 mL，每組早晚2次，連續15 d。15 d中連續觀察大鼠皮毛光澤、活動范圍、進食量及排便情況。

1.4 檢測指標

①觀察大鼠皮毛光澤情況、活動范圍、進食量和排便情況。②觀察大鼠結腸大體形態，殘留糞粒數量、每粒糞便質重及大鼠體質量的變化。③進行結腸c-kit免疫組化染色半定量分析。免疫組化結果判斷：棕黃色為陽性信號，以“－、+、++、+++”表達染色的深淺。(－)為陰性染色，(+)為弱陽性染色，(++)為陽性染色，(+++)為強陽性染色。④在400倍光學顯微鏡下觀察ICC形態并計數陽性細胞數。

取材及標本處理：停藥后大鼠禁食不禁水12 h;將各組大鼠頸椎脫臼處死，打開腹腔，分離大腸;切取結腸段區域環肌層組織約1 cm，縱向剪開，在預冷的生理鹽水中清洗去除內容物;放入100 g/L甲醛溶液中固定24 h，常規脫水，石蠟包埋;采用連續橫斷面組織切片切取厚4 μm組織塊;每張載玻片上貼4個組織塊，40℃烘干10 h，常規HE染色和c-kit免疫組化染色，c-kit免疫組化染色按試劑盒步驟進行。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠皮毛光澤、活動范圍、進食量和大便情況對比

模型對照組大鼠皮毛枯少無光、神情呆滯、活動力不佳、活動范圍小、愛扎堆、進食少、大便硬且少。空白對照組大鼠皮毛光滑、精神活潑，活動范圍大、進食好且量多、大便軟而成形。白術低、中劑量組大鼠的表現與空白對照組大鼠相差不大，但中劑量組稍好于低劑量組;白術高劑量組的上述諸指標不佳，與模型對照組大鼠相似。

2.2 各組大鼠結腸大體形態觀察、殘留糞粒數量、每粒糞便質重、大鼠體質量變化對比

模型對照組大鼠結腸明顯粗大、迂曲，腸腔內有較大塊較多粒糞便存留，與空白對照組對比差別有統計學意義(P＜0.05)。白術各組大鼠結腸呈一般粗大、迂曲，腸腔內存留較小塊較少粒糞便，與模型對照組對比差別有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。各組大鼠在給藥前體質量差別均無統計學意義(P＞0.05)。處死前的各組大鼠體質量對比：模型對照組與空白對照組間差別有統計學意義(P＜0.05)，白術各劑量組與模型對照組間差別有統計學意義(P ＜0.05或 P ＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠結腸內殘留糞粒數量、每粒糞便質重、大鼠體質量變化對比 n=12，±s

表1 各組大鼠結腸內殘留糞粒數量、每粒糞便質重、大鼠體質量變化對比 n=12，±s

注：與空白對照組對比，*P ＜0.05;與模型對照組對比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 糞便粒數/(粒·只－1) 糞便質重/(mg·粒－1) 給藥前體質量/(mg·只－1) 處死前體質量/(mg·只－1)空白對照組7 ±2.6 81.6 ±9.1 262 ±11.56 351 ±20.67模型對照組 9 ±1.8* 153.4 ±13.3* 254 ±22.52 276 ±20.14*白術低劑量組 6 ±2.3# 106.6±7.5# 260±18.23 287 ±19.58#白術中劑量組 4 ±1.9## 89.6 ±10.2## 258±19.35 367 ±21.63##白術高劑量組 8 ±3.1# 131.6±11.7# 253±21.41 290 ±17.72#

2.3 各組大鼠結腸c-kit免疫組化染色半定量分析

大鼠結腸黏膜HE染色顯示上皮細胞核呈藍色，胞漿為棕黃色。各組大鼠結腸免疫組化染色半定量分析對比，差別均有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠結腸c-kit免疫組化染色半定量分析n=12，個

2.4 各組大鼠結腸ICC形態與數量對比

空白對照組可見ICC核大，圓形或卵圓形，核周胞漿少;核周胞漿向不同方向發出2～5條長突起，可有2級分支;細胞位于神經節纖維的三級分支所形成的網眼中，胞體或其發出的突起與神經纖維關系密切，但不相連。白術低劑量組、白術中劑量組鏡下所見ICC形態與空白對照組相似，區別不大;而模型對照組及白術高劑量組ICC均有所改變，形態出現異常，核周胞漿突起變鈍、變短。

白術低劑量組、白術中劑量組鏡下所見ICC數量與空白對照組相近，但白術中劑量組相對于白術低劑量組而言與空白對照組數值更接近，且高于空白對照組;而模型對照組及白術高劑量組陽性細胞數量均明顯少于前3組，且模型對照組數值為5組中最低。模型對照組與空白對照組對比，差別有統計學意義(P＜0.05);白術各劑量組與模型對照組對比，差別有統計學意義(P ＜0.05或 P ＜0.01)。見表3。

表3 各組大鼠結腸400倍光鏡下ICC陽性細胞數量對比n=12，± s

表3 各組大鼠結腸400倍光鏡下ICC陽性細胞數量對比n=12，± s

注：與空白對照組對比，* P＜0.05;與模型對照組對比，#P＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 400倍光鏡下ICC陽性細胞數量/個空白對照組85.82 ±4.12模型對照組 53.58 ±8.37*白術低劑量組 78.36 ±5.14#白術中劑量組 87.47 ±3.04##白術高劑量組 58.74 ±6.81#

3 討論

近來的研究［3］發現：ICC數量及分布的改變在STC的發病中可能起著重要的作用。Lee等［4］對STC患者乙狀結腸標本研究發現：各層組織中ICC數量均減少。中醫學認為：脾胃氣虛是STC發病的主要病機，健脾益氣是治療STC的基本原則。白術性溫味苦甘，歸脾胃經，功能分健脾益氣、燥濕利水、固表止汗、安胎。本研究表明：白術治療STC不是單純促進腸管蠕動而通便，而是通過改善結腸ICC形態并提高ICC數量而取效。生白術單用治療STC需大量，但宜控制在60 g左右，這與魏龍驤老中醫經驗相符。

［1］Aguchi T，Suita S，Masumoto K，et al.Universal distribution of c-kit-positive cells in different types of Hirschsprung＇s disease［J］.Pediatr Surg Int.2003，19(4)：273.

［2］魏龍驤.談白術治便秘［J］.新醫藥學雜志，1978，11(4)：9.

［3］Aguchi T，Suita S，Masumoto K，et a1.Universal distribdtion of c-kit-positive cells in different types of Hirschsprung＇s disease［J］.Pediatr Surg Int，2003，19(4)：273.

［4］Lee JI，Park H，Kamm MA，et a1.Decreased density of interstitial cells of Cajal and neuronal cells in patients with slowtransit constipation and acquired megacolon［J］.J G astroenterol Hepatol，2005，20(8)：1292 －1298.

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001 －6910.2012.09.030

江西省教育廳青年科學基金項目(編號GJJ09629)

2011－12－09;

2012－03－28

(編輯 陶 珠)