穩(wěn)心草黃酮類化合物對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及血管緊張素Ⅱ的影響*

竇志強(qiáng)，戴恩來(lái)，薛國(guó)忠

(1.定西市人民醫(yī)院，甘肅 定西 743000;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000;3.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020)

穩(wěn)心草黃酮類化合物對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及血管緊張素Ⅱ的影響*

竇志強(qiáng)1，戴恩來(lái)2，薛國(guó)忠3

(1.定西市人民醫(yī)院，甘肅 定西 743000;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000;3.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020)

目的：通過(guò)觀察穩(wěn)心草黃酮類化合物對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平變化的影響，探討其防治肺動(dòng)脈高壓的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為中藥開發(fā)提供基礎(chǔ)研究資料。方法：穩(wěn)心草品種由藥學(xué)專家進(jìn)行植物基源鑒定，穩(wěn)心草黃酮類化合物委托甘肅中醫(yī)學(xué)院科研中心提取并鑒定。用原代培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，采用四氮唑藍(lán)比色法(MTT法)測(cè)定細(xì)胞增殖，采用放射免疫法檢測(cè)細(xì)胞外AngⅡ含量的變化。結(jié)果：穩(wěn)心草黃酮類化合物對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞有抑制增殖的作用，與空白對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);穩(wěn)心草黃酮類化合物各劑量組AngⅡ含量低于空白對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且AngⅡ含量降低的程度與藥物劑量呈一定的正相關(guān)。結(jié)論：穩(wěn)心草黃酮類化合物對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞有抑制增殖的作用，機(jī)制可能是其通過(guò)對(duì)AngⅡ的抑制，此可能是穩(wěn)心草黃酮類化合物具有一定的降低肺動(dòng)脈高壓作用的原因之一。

穩(wěn)心草黃酮類化合物/藥效學(xué);肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞/藥物作用;血管緊張素Ⅱ;細(xì)胞增殖;肺動(dòng)脈高壓;細(xì)胞培養(yǎng)

肺動(dòng)脈高壓是一類以肺血管阻力進(jìn)行性升高為主要特征的疾病。大量研究證明：肺動(dòng)脈高壓與肺血管結(jié)構(gòu)重塑顯著相關(guān)。研究肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制，是探討低氧肺動(dòng)脈高壓、慢性肺原性心臟病及其他血管疾病發(fā)生機(jī)制的重要方向;而抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，成為治療低氧性肺動(dòng)脈高壓的一個(gè)重要思路。AngⅡ?yàn)榇碳ぱ芷交〖?xì)胞遷移和增殖的強(qiáng)效收縮因子，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)遷移和增殖、促進(jìn)新內(nèi)膜形成起重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察穩(wěn)心草黃酮對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及血管緊張素Ⅱ的影響，為該藥治療肺動(dòng)脈高壓提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

3月齡健康SPF級(jí)Wistar雄性大鼠20只，購(gòu)于甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量(180±20)g，質(zhì)量合格證號(hào) SCXK(甘)2004－007－0001542。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境SPF級(jí)，合格證號(hào)SYXK(甘)2004－006－0001597。

1.2 藥品、試劑與儀器

穩(wěn)心草，購(gòu)自甘肅宕昌，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室李成義教授鑒定為正品;穩(wěn)心草黃酮類化合物，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研中心生藥研究室提取，該藥穩(wěn)心草總黃酮的含量是735 g/L。四氮唑藍(lán)(MTT)試劑，華美生物工程公司產(chǎn)品;十二烷基磺(硫)酸鈉(SDS)，購(gòu)自蘭州鵬程生物公司;二甲基亞砜分析純，天津化工試劑廠產(chǎn)品;臺(tái)盼藍(lán)，購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司;碘化丙啶PI，購(gòu)自華美生物工程公司;DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺(L-glutamine)、胰蛋白酶粉(1∶250)及Ⅱ型膠原酶，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;新生牛血清，購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司，批號(hào)060513;青霉素鈉，華北制藥廠產(chǎn)品，批號(hào)A051212006;鏈霉素，哈爾濱制藥六廠產(chǎn)品，批號(hào)050408;碘(125I)血管緊張素Ⅱ放射免疫分析藥盒，購(gòu)自北京科美東亞生物技術(shù)有限公司。奧林巴斯IX71型倒置相差光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司;JEM－1230透射電鏡，產(chǎn)地日本;LKB-V超薄切片機(jī)，產(chǎn)地瑞典;XL型流式細(xì)胞儀，美國(guó)Coulter公司;RT2100型酶標(biāo)儀，美國(guó)雷杜產(chǎn)品;DG－5031型酶標(biāo)儀，國(guó)營(yíng)華東電子管廠區(qū)產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

斷頸處死大鼠，以750 g/L乙醇浸泡消毒2 min;迅速分離取出肺動(dòng)脈，以PBS液清洗去除血污，獲干凈光滑的管段;用眼科鑷固定血管段端，刀片輕刮去除外膜結(jié)締組織;用眼科剪小心剖開血管，刮去內(nèi)膜層細(xì)胞;將血管段剪成1 mm3大小的組織塊，均勻貼放于25 mL培養(yǎng)瓶底面，組織塊隙約2～3 mm;加入體積分?jǐn)?shù)為20%的新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液2～3 mL，輕晃培養(yǎng)瓶使培養(yǎng)液掠過(guò)組織塊，翻轉(zhuǎn)靜置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中3～5 h;再次翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織塊浸沒于培養(yǎng)液中，半開放式絕對(duì)靜置培養(yǎng)3 d;3～5 d時(shí)首次換液［7］;于第5～7天，在光鏡下觀察，有梭形的細(xì)胞從組織塊邊緣長(zhǎng)出;于第10～12天長(zhǎng)成密集的不均勻的單層或多層細(xì)胞。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

分藥物組和空白對(duì)照組6組：藥物組分別加入不同劑量的穩(wěn)心草黃酮，空白對(duì)照組加入等量的PBS。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

采用增殖四氮唑藍(lán)比色法(MTT法)測(cè)定。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMC)，鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好。用移液器吸去培養(yǎng)液，加入PBS緩沖液液3 mL清洗細(xì)胞兩次;加入1.25 g/L胰蛋白酶消化液2～3 mL，置于倒置相差光學(xué)顯微鏡下觀察;待細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大時(shí)翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶脫離細(xì)胞，吸除消化液，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液4～6 mL終止消化，并輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力，鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞活力在95%以上。將細(xì)胞混懸液移入離心管以2000 r/min離心10 min，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整為1×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板。每板接種5個(gè)不同藥物劑量的藥物組和1個(gè)空白對(duì)照組，共6個(gè)組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入90 μL細(xì)胞懸液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2常氧細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，待細(xì)胞生長(zhǎng)基本匯合后小心吸除孔中培養(yǎng)液及藥物;各藥物組分別在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同劑量穩(wěn)心草黃酮類化合物10 μL，空白對(duì)照組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入等量的PBS，調(diào)零孔只加等量的培養(yǎng)液(無(wú)細(xì)胞)，全濕條件下，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);分別于加藥后24，48，72及96 h在各孔加入MTT 10 μL;繼續(xù)培養(yǎng)4 h，分別在各孔中加入100 μL十二烷基硫酸鈉(SDS)終止培養(yǎng);12 h后，待結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔在490 nm處的吸光度(OD)值，按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.5.2 AngⅡ含量

①原理：采用液相競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析法，直接測(cè)定血漿中血管緊張素Ⅱ的含量。先將校樣品(或樣品)、標(biāo)記物和抗體按操作程序依次加入試管中，使標(biāo)記和非標(biāo)記抗原與有限量抗體互相競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，待反應(yīng)平衡后，加入分離劑，離心沉淀，使游離抗原與抗原抗體復(fù)合物分離，測(cè)定沉淀物的放射強(qiáng)度。隨AngⅡ含量增加，其放射性強(qiáng)度則相應(yīng)降低。

②方法：采用放射免疫法檢測(cè)。將圓底聚苯乙烯試管編號(hào)(復(fù)管)，按碘(125I)血管緊張素Ⅱ放射

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)心草黃酮類化合物對(duì)PASMC增殖的影響

穩(wěn)心草黃酮類化合物50 mg/L抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的作用不明顯，隨著劑量的增大，穩(wěn)心免疫分析藥盒上的加樣測(cè)定程序表方法操作，操作要求在冰水浴中進(jìn)行。數(shù)據(jù)處理：以B/B0為縱坐標(biāo)，以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，在Logit－Log坐標(biāo)紙上繪制校準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品B/B0，從校準(zhǔn)曲線上查出樣品的含量，用自動(dòng)r計(jì)數(shù)儀預(yù)先編制的程序直接給出有關(guān)參數(shù)、校準(zhǔn)曲線及樣品濃度。草黃酮類化合物作用于 PASMC 24 h、48 h、72 h、96 h，均有抑制PASMC增殖的作用;從抑制率看，藥物濃度與抑制PASMC增殖程度成正相關(guān)。比較同一劑量下，穩(wěn)心草黃酮類化合物作用于 PASMC 24 h、48 h、72 h、96 h的抑制率結(jié)果，提示穩(wěn)心草黃酮類化合物作用于PASMC 48 h時(shí)其抑制平滑肌細(xì)胞增殖的效果最明顯，抑制率為23.48%。見表1～2。

表1 穩(wěn)心草黃酮類化合物作用于PASMC 48 h的MTT 結(jié)果分析 n=6，±s

表1 穩(wěn)心草黃酮類化合物作用于PASMC 48 h的MTT 結(jié)果分析 n=6，±s

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，*P ＞0.05，＊＊ P ＜0.05。

組 別8 h A 抑制率/%空白對(duì)照組0.400 ±0.023 0.00穩(wěn)心草黃酮類化合物50 mg·L －1組 0.394±0.027* 1.51穩(wěn)心草黃酮類化合物100 mg·L －1組 0.377±0.039* 5.75穩(wěn)心草黃酮類化合物200 mg·L－1組 0.340±0.033＊＊ 15.12穩(wěn)心草黃酮類化合物400 mg·L－1組 0.327±0.045＊＊ 18.25穩(wěn)心草黃酮類化合物800 mg·L －1組 0.313±0.015＊＊21.75

表2 穩(wěn)心草黃酮類化合物作用于PASMC 24 h、48 h、72 h、96 h的MTT結(jié)果分析 n=4，±s

表2 穩(wěn)心草黃酮類化合物作用于PASMC 24 h、48 h、72 h、96 h的MTT結(jié)果分析 n=4，±s

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，＊＊ P＜0.05。

組 別/%正常對(duì)照組 0.396 ±0.124 0.00 0.553 ±0.027 0.00 0.693 ±0.0 24 h A 抑制率/%48 h A 抑制率/%72 h A 抑制率/%96 h A 抑制率37 0.00 0.817 ±0.051 0.00穩(wěn)心草黃酮類化合物200 mg·L －1組 0.345±0.018＊＊ 12.96 0.465±0.030＊＊ 15.93 0.604±0.026＊＊ 12.93 0.752±0.026 8.01穩(wěn)心草黃酮類化合物400 mg·L －1組 0.339±0.043＊＊ 14.38 0.448±0.015＊＊ 19.01 0.576±0.035＊＊ 17.03 0.745±0.044 8.87穩(wěn)心草黃酮類化合物800 mg·L －1組 0.329±0.033＊＊ 17.05 0.423±0.049＊＊ 23.48 0.560±0.028＊＊ 19.27 0.732±0.036＊＊10.42

2.2 穩(wěn)心草黃酮類化合物對(duì)細(xì)胞外AngⅡ含量的影響

與空白對(duì)照組對(duì)比，穩(wěn)心草黃酮類化合物各劑量組AngⅡ含量降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果顯示：AngⅡ降低的程度與藥物劑量呈正相關(guān)。見表3。

表3 穩(wěn)心草黃酮類化合物對(duì)細(xì)胞外AngⅡ含量的影響n=5± s

表3 穩(wěn)心草黃酮類化合物對(duì)細(xì)胞外AngⅡ含量的影響n=5± s

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，＊＊ P＜0.05。

組 別 AngⅡ含量/(μg·L－1)正常對(duì)照組＊＊402.31 ±47.24穩(wěn)心草黃酮類化合物200 mg·L－1組 334.68 ±23.51＊＊穩(wěn)心草黃酮類化合物400 mg·L－1組 261.33 ±20.29＊＊穩(wěn)心草黃酮類化合物800 mg·L－1組 211.40 ±15.54

3 討論

肺動(dòng)脈高壓的多表現(xiàn)于中醫(yī)學(xué)“肺脹”的全過(guò)程中，肺脹由多種慢性肺系疾病轉(zhuǎn)歸而成。肺動(dòng)脈高壓臨床表現(xiàn)為胸部膨滿，脹悶如塞，喘咳上氣，痰多，煩躁、心慌，甚則見唇甲紫紺。病久可見面色晦暗，面唇紫紺，脘腹脹滿，肢體浮腫，甚或昏迷、抽搐以至喘脫等危重癥候。根據(jù)其癥狀表現(xiàn)與中醫(yī)學(xué)“咳喘”“痰飲”“心悸”“水腫”“喘厥”等證有關(guān)。病因肺為華蓋之臟，邪氣首先犯肺，肺失宣降，發(fā)為肺病;久病肺虛為主，由于反復(fù)感邪，使病情進(jìn)行性加重。病位在肺，日久不愈，反復(fù)發(fā)作，正氣必衰，進(jìn)而累及脾、腎、心等臟俱虛，可出現(xiàn)肺脾腎陽(yáng)氣衰微，氣不化水，水飲凌心射肺而引起咳喘或喘脫及水腫。病理性質(zhì)多由氣虛、氣陰兩虛發(fā)展為陽(yáng)虛，在病程中且可形成痰、飲、瘀等病理產(chǎn)物。臨床常見痰濁壅肺、痰熱郁肺、痰蒙神竅、肺腎氣虛、陽(yáng)虛水泛等5個(gè)證候，各證常可互相兼夾轉(zhuǎn)化。肺氣的宣降失常、痰飲內(nèi)生、瘀血阻滯是肺動(dòng)脈高壓形成并伴隨疾病全過(guò)程的基本病理機(jī)制。以肺脹來(lái)代替肺動(dòng)脈高壓加以討論是比較合適的。目前肺動(dòng)脈高壓病理生理復(fù)雜，故其防治尚未取得突破性進(jìn)展。

穩(wěn)心草(Hypericum attenuatumChoisy.)，又名趕山鞭、黑點(diǎn)葉金絲桃［1］，為藤黃科金絲桃屬植物，是民間常用的中草藥，常用于心臟病的治療［2］。有研究［3］證實(shí)：穩(wěn)心草在改善慢性克山病患者癥狀的同時(shí)，還對(duì)肝臟腫大、浮腫、頸靜脈充盈有一定效果，從而使心功能獲得不同程度的好轉(zhuǎn)。穩(wěn)心草的化學(xué)成分主要為黃酮類化合物。顧麗貞等［4］測(cè)定全草中黃酮類化合物含量平均為1.67%，董建勇等［5］對(duì)從甘肅產(chǎn)穩(wěn)心草的地上部分分離出了11種黃酮化合物。國(guó)內(nèi)外學(xué)者［6］發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物有多種藥理作用，包括：①清除自由基、抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，降低過(guò)氧化脂質(zhì)含量、提高紅細(xì)胞超氧化物歧化酶活性。②對(duì)心肌缺血引起的心功能紊亂有保護(hù)作用，增加冠脈血流及頸動(dòng)脈流量，抗心肌及腦缺血。③防止血栓形成和抗血小板聚集。④抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。⑤降低血三酰甘油酯和提高高密度脂蛋白的含量。

本結(jié)果顯示：穩(wěn)心草黃酮類化合物在劑量較大時(shí)對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性，藥物的最佳作用時(shí)間為48 h，此時(shí)抑制率為23.48%。穩(wěn)心草黃酮類化合物能降低肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外AngⅡ水平，兩者呈正相關(guān)。此可能是其降低肺動(dòng)脈高壓的基礎(chǔ)因素之一。

本研究為穩(wěn)心草黃酮類化合物具有抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為開發(fā)治療肺動(dòng)脈高壓的中藥新藥提供了基礎(chǔ)研究資料。

［1］中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第五十卷第二分冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，1990：69.

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：下冊(cè)［M］.上海：上海人民出版社：1823.

［3］黑龍江省呼倫貝爾盟地方病防治研究所.穩(wěn)心草對(duì)慢性克山病初步治療觀察［J］.黑龍江醫(yī)藥，1976，3：46 －48.

［4］顧麗貞，張宏彬.穩(wěn)心草化學(xué)成分的研究［J］.植物學(xué)報(bào)，1980，22(2)：151.

［5］董建勇，賈忠建.趕山鞭中黃酮類化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，12(40)：897 －899.

［6］劉文麗，于魯海，馬燕.紫外分光光度法在黃酮類化合物含量測(cè)定中的應(yīng)用［J］.新疆中醫(yī)藥，2006，24(3)：85 －86.

1001－6910(2012)09－0055－04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001 －6910.2012.09.029

戴恩來(lái)，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，E-mail：daienlai@sohu.com

甘肅省自然科學(xué)基金暨中青年科技基金項(xiàng)目(編號(hào)ZS031－A25－077－E)

2011－12－05;

2012－04－05

(編輯 陶 珠)

·學(xué)術(shù)探討·