櫛孔扇貝NDPK基因的BAC-FISH定位研究

黃 超, 郇 聘, 張曉軍, 相建海

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100049)

櫛孔扇貝NDPK基因的BAC-FISH定位研究

黃 超1,2, 郇 聘1, 張曉軍1, 相建海1

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100049)

櫛孔扇貝(Chlamys farreri)是我國北部沿海一個非常重要的養殖種類。核苷二磷酸激酶(NDPK)是一類廣泛存在、高度保守, 在細胞能量和信息傳遞中具有重要作用的酶。作者利用BAC-FISH技術將兩個包含櫛孔扇貝 NDPK基因的 BAC克隆定位到染色體同一位置上, 該結果驗證了物理圖譜相關contig組裝的可靠性, 同時NDPK基因的染色體定位將對深入研究該基因的結構、功能以及應用于生產實踐提供理論支撐。本研究結果將對櫛孔扇貝染色體的深入研究以及染色體鑒別、圖譜整合等工作提供重要參考。

櫛孔扇貝(Chlamys farreri); 核苷二磷酸激酶; 熒光原位雜交; BAC; 染色體鑒別

櫛孔扇貝(Chlamys farreri)是中國最重要的海水養殖品種之一。近年來, 病害問題成為櫛孔扇貝養殖業發展的制約因素。人們逐漸認識到加強遺傳學基礎、免疫機制等研究是解決櫛孔扇貝病害問題的關鍵, 在此基礎上, 許多櫛孔扇貝的功能基因得到了克隆并開展了一系列深入研究[1-9]。

核苷二磷酸激酶(NDPK)基因在進化中高度保守,卻又呈現復雜多樣的生物學功能。NDPK基因編碼的核苷二磷酸激酶是一類廣泛存在的酶, 它通過一種乒乓機制將結合在蛋白質上的二磷酸核苷(5'NDP)磷酸化為三磷酸核苷(5'NTP), 調節細胞內的能量池大小, 進而活化蛋白質。該酶除了催化ATP和 NDP之間高能磷酸基團的轉移外, 還具有NDP激酶活性和蛋白磷酸轉移酶活性, 并參與包括免疫反應在內的轉錄調控和信號轉導[10]。

熒光原位雜交技術(Fluorescencein situhybridization, FISH)是利用核酸探針直接在染色體上定位特定靶DNA序列的技術, 它能將基因組的DNA序列和染色體直接關聯起來, 在宏觀的細胞學和微觀的分子生物學之間架起一座橋梁[11]。在櫛孔扇貝中,通過FISH技術已經成功定位了一些多拷貝基因, 包括18S核糖體RNA基因、組蛋白基因等[12-13]。然而對于包括NDPK基因在內的大多數低拷貝功能基因,常規的FISH技術難以實現定位。其原因在于, 用常規的FISH方法這些低拷貝序列難以產生足夠強的信號[14]。對于這些低拷貝序列, 一些大片段克隆如fosmid、BAC等, 可以提供足夠長的探針來產生可檢測的信號[15]。2008年, Zhang等[16]構建了櫛孔扇貝細菌人工染色體(BAC, Bacterial Artificial Chromosome)基因組文庫, 使得以 BAC質粒為探針的 FISH技術(BAC-FISH)的應用成為可能, 為低拷貝功能基因的染色體定位提供了可靠的探針來源。在對 BAC文庫的篩選中, 獲得了兩個包含櫛孔扇貝NDPK基因的陽性克隆[16]。最近, 作者構建了基于BAC指紋的櫛孔扇貝物理圖譜, 從該圖譜上看, 這兩個包含NDPK基因的BAC克隆位于同一個contig(重疊群)上的, 可以推測這兩個克隆在染色體上是臨近或重疊的, 因此可以通過FISH技術在實現NDPK基因染色體定位的同時, 驗證該物理圖譜contig組裝結果的可靠性。

本研究以包含櫛孔扇貝NDPK基因的兩個BAC克隆為探針, 利用 BAC-FISH技術將 NDPK基因定位到櫛孔扇貝細胞核和有絲分裂中期分裂相上, 初步驗證物理圖譜的組裝, 為櫛孔扇貝 NDPK基因的后續深入研究提供了基礎, 同時可以為櫛孔扇貝染色體的鑒別工作提供了一種特異性探針。

1 材料與方法

1.1 BAC克隆的來源和驗證

在前期本實驗室對櫛孔扇貝BAC文庫的篩選過程中, 獲得了兩個包含 NDPK基因的陽性克隆CBE068E24和CBE099F20[16]。進一步根據其cDNA序列設計引物組合NDPKF (5′-GTAAAGATGTCCGACCCTTT-3′)和 NDPKR (5′-TTAATCTTATGCCAGATTTTCT-3′)以BAC克隆CBE068E24和CBE099F20為模板進行PCR反應驗證。PCR擴增產物轉化入宿主菌, 測序分析。

1.2 櫛孔扇貝染色體制備

成體櫛孔扇貝購自青島市小港市場。在繁殖期,選取性腺發育飽滿的個體, 陰干刺激后分別排出精子和卵子, 控制精卵的比例進行受精。第2天取孵化出的擔輪幼蟲, 在 0.01%的秋水仙素溶液中孵育2.5 h, 轉移到0.075 mol/L的KCl溶液中低滲15 min,低滲后使用新鮮配制的 Canoy氏固定液(甲醇：乙醇為3：1)固定2次, 每次15 min, 然后轉入甲醇：乙醇為1：1的儲存液中, －20℃保存備用。

取固定好的單輪幼蟲樣品中加入 50%乙酸解離組織, 從約50 cm高的地方將細胞懸液滴至預熱50℃的載玻片上, 空氣干燥。

1.3 探針合成及雜交緩沖液制備

BAC質粒的提取使用 Machery-Nagel公司的NucleoBond AX 100 kit完成。取1 μg質粒, 利用缺口平移法制備地高辛或生物素標記的探針(Digoxigenin Nick Translation Mix, Biotin Nick Translation Mix, Roche), 在試劑盒提供的預混合溶液中(包含反應緩沖液、dNTP、地高辛或生物素標記的dUTP、DNase I)加入 1 μg BAC 質粒, 37℃保溫 90 min使地高辛或生物素標記的dUTP摻入產物分子中, 反應結束后加入1 μL EDTA 65℃保溫10 min以停止反應, 合成好的探針用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測片段大小及分布。

在BAC探針雜交的過程中, 使用Cot-1 DNA封閉探針中可能存在的重復序列。Cot-1 DNA的制備按照Zwick描述的方法完成[17]。

制備好的探針與10倍的Cot-1 DNA及50倍的鮭精DNA共沉淀, 溶于雜交緩沖液(50%去離子甲酰胺, 2×SSC, 10%硫酸葡聚糖, 50 mmol/L的磷酸緩沖液, pH7.0)中, 使探針終質量濃度為16.67 μg/ L, 即得到可用于BAC-FISH的雜交緩沖液。

1.4 熒光原位雜交

染色體片先用0.16%pepsin預處理37℃30 min,去除多余的蛋白成分, 之后轉入 2×SSC中漂洗2 min。將染色體片置于70%去離子甲酰胺中, 68℃2 min使DNA變性, 立即轉入冰凍的梯度乙醇中脫水, 脫水后自然干燥。

開始雜交前, 將探針雜交液置PCR中78℃變性3 min, 然后37℃孵育1 h, 進行預退火, 以封堵探針中的重復序列。預退火結束后, 將探針雜交液加到染色體片上, 蓋上硅烷化處理的蓋玻片, 石蠟油封片,置黑暗濕盒中, 37℃雜交14～22 h。雜交完成后, 將染色體片在 45℃下, 依次在 2×SSC-50%甲酰胺和0.2×SSC中洗脫各2次, 每次5 min, 以洗去非特異雜交的探針。洗脫完成后, 依次使用 mouse-antidigoxigenin、FITC-rabbit-anti-mouse和 FITC-goatanti-rabbit (生物素標記的使用 Rhodamine-Avidin、Biotin-anti-Avidin、Rhodamine-Avidin) 進行免疫熒光檢測和信號擴增, 使用 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)對染色體進行復染, Nikon 80i熒光顯微鏡觀察, NIS-element(Nikon)冷CCD照相, 所得照片用Photoshop(Adobe)進行合成及對比度調整。

1.5 BAC-FISH

首先作者對 CBE068E24和CBE099F20克隆分別進行了單色BAC-FISH的定位(如1.4所述)。為了進一步研究包含同一個基因的陽性克隆是否來自于基因組上同一的位點, 必須進行雙色甚至多色BAC-FISH的實驗, 以便提供多個克隆之間的相對位置關系。為此作者對包含櫛孔扇貝 NDPK基因的兩個陽性克隆進行了雙色 FISH的試驗。在雙色BAC-FISH中對其中一個進行地高辛標記, 另一個用生物素標記, 將這兩個探針混合進行雙色BAC-FISH實驗, 驗證是否共定位。將不同標記的兩個探針等量添加, 探針雜交液的成分為：50%去離子甲酰胺, 2×SSC, 10%硫酸葡聚糖, 50 mmol/L磷酸緩沖液, 833 μg/L 鮭精 DNA, 166 μg/LCot-1 DNA,16.67 μg/L Dig- CBE068E24, 16.67 μg/L Biotin-CBE099F20。實驗過程同1.4所述。

2 結果與分析

2.1 BAC克隆的驗證

由引物組合NDPKF和NDPKR分別以BAC克隆CBE068E24和CBE099F20為模板進行PCR反應,得到同樣的片段, 大小在500～750 bp之間。測序分析該片段長約600 bp, 經過Blast比對屬于櫛孔扇貝NDPK基因(圖1), 進一步證實了 BAC克隆CBE068E24和 CBE099F20中含有櫛孔扇貝 NDPK基因。

圖1 BAC克隆驗證PCR的的測序結果Fig.1 The sequenc of PCR product of NDPK BAC

2.2 探針制備

提取高純度CBE068E24和CBE099F20的BAC質粒DNA為模板, 缺口平移法制備地高辛和生物素標記的探針。經瓊脂糖凝膠電泳檢測, 反應產物片段分布于 200～500 bp(圖2)。

2.3 熒光原位雜交

在由櫛孔扇貝擔輪幼蟲制得的分散良好的中期分裂相上, 用來自于 BAC克隆 CBE068E24和CBE099F20的兩個探針分別進行了染色體定位研究。結果如圖3(a, b)示, 克隆 CBE068E24和CBE099F20都定位于一對同源染色體的長臂上, 雜交信號明亮, 沒有發現信號數量和位置的明顯變化。

在分別用地高辛和生物素標記的兩個克隆的同時雜交的結果中顯示, 含有 NDPK基因的這兩個BAC克隆定位在細胞核的同一個位置(圖4a,b,c), 可以判斷它們是共定位的。

3 討論

本研究利用 BAC-FISH技術在櫛孔扇貝染色體上首次定位了包含NDPK基因的BAC克隆, 確定了兩個BAC克隆定位在染色體上同一位置上, 驗證了物理圖譜中相關 contig組裝結果的可靠性, 同時也為NDPK基因的后續基因組結構和功能研究打下了基礎。

圖2 以BAC質粒為模板, 缺口平移法制備的地高辛標記的探針Fig. 2 Preparation of DIG-labeled probe by nick-translation using BAC DNA as the template

20世紀90年代初, 王梅林等[18]報道了櫛孔扇貝的核型, 櫛孔扇貝的染色體研究由此開始。到了 90年代末, 隨著分子生物學和熒光原位雜交技術逐漸在貝類染色體研究上得到應用, 櫛孔扇貝染色體研究進入到分子細胞遺傳學階段。近年來, Wang等[19]利用FISH技術在櫛孔扇貝上定位了18-5.8-28S和5S rDNA序列, Huang等[12]和Zhang等[13]在櫛孔扇貝染色體上成功定位了18S rDNA和組蛋白基因。這些基因的定位不僅顯示了它們在染色體上的位置, 更重要的是這些位置信息有助于單個染色體的鑒別, 這對于染色體微切割、非整倍體鑒定及全基因組測序安裝等均具有重要的應用價值。利用大片段克隆的FISH定位技術開發染色體特異性探針是一種很有前途的染色體鑒別方法, 與高度重復序列和多拷貝基因探針相比, 大片段克隆由于具有序列獨特和來源豐富的優點成為染色體特異性探針最好的來源。Wang等[20]利用9個P1克隆以及染色體的形態特點成功地同時鑒別了東方牡蠣(Crassostrea virginica)的10條染色體; Zhang等[14]利用8個Fosmid克隆鑒別了櫛孔扇貝的8條染色體; Huan等[21]利用BAC-FISH技術對櫛孔扇貝18S rDNA、組蛋白基因h3以及包含免疫相關基因的3個BAC克隆共5個探針進行了同時定位, 可以同時鑒定5條櫛孔扇貝染色體。本研究結果顯示包含NDPK基因的BAC克隆定位到櫛孔扇貝的 1對同源染色體上, 這使其成為一個理想的染色體特異性探針; 同時本研究使用的BAC克隆具有明顯的功能基因標簽-NDPK基因, 因此在鑒別染色體的同時也起到了定位基因的作用。

圖3 單色FISH地高辛標記CBE068E24(a)和地高辛標記CBE099F20(b)Fig.3 Monocolor FISH DIG-labeled CBE068E24(a) and DIG-labeled CBE099F20(b)

圖4 含有NDPK基因的這兩個BAC克隆的共定位Fig. 4 Colocalization of the two BAC clones containing NDPK gene

目前本實驗室已經構建了櫛孔扇貝高密度物理圖譜, 作者通過FISH技術實現了兩個包含NDPK基因的BAC克隆的染色體共定位, 從細胞學的角度直觀地驗證了物理圖譜上兩個克隆組裝結果的正確性。如果能開發出與NDPK基因連鎖的分子標記, 并將其定位到遺傳連鎖圖上, 則可實現該基因在遺傳連鎖圖譜、物理圖譜和染色體上的同時定位。隨著這種同時定位的標記不斷增加, 從而實現物理圖譜、遺傳連鎖圖譜和細胞遺傳圖譜的整合, 這對于櫛孔扇貝基因組結構研究、全基因組測序組裝和重要經濟性狀的圖位克隆具有重要的意義。

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Chromosomal localization of NDPK gene in Zhikong scallopChlamys farreriusing BAC-FISH

HUANG Chao1,2, HUAN Pin1, ZHANG Xiao-jun1, XIANG Jian-hai1
(1. Key Laboratory of Experimential Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Science, Qingdao 266071, China; 2. Graduate University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China)

Mar., 12, 2011

Zhikong scallop,Chlamys farreri, NDPK gene, BAC-FISH, Chromosomal identification

Zhikong scallop(Chlamys farreri) is one of the most economically important aquaculture species in China. Using the technology of BAC-FISH, we localized the BAC clones containing NDPK gene in a pair of homologous chromosomes. This result proved the reliability of the contig assembling of theC. farreriphysical map, at the same time, the localization of NDPK gene in chromosome provided further support for research of structures,functions and the application of the gene. This research is the practice of localizing genes of low copies. The result will provide reference to further research and characterization ofC. farrerichromosomes, and will facilitate the integration of the physical map, linkage map and cytogenetics map of this species.

Q23 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2012)01-0001-05

2011-03-12;

2011-06-15

國家自然科學基金項目(30730071, 30972245); 農業部農業科技成果轉化資金項目(2010GB24910700)

黃超(1986-), 男, 山東棗莊人, 碩士研究生, 主要從事海洋生物基因組學及細胞遺傳學研究, 電話：0532-82898570, E-mail：zosdubc@126.com; 張曉軍, 通信作者, 副研究員, 電話：0532-82898786, E-mail：xjzhang@qdio.ac.cn

梁德海)