飼料粗蛋白含量對刺參消化酶及消化道結構的影響

吳永恒, 王秋月, 馮政夫, 李彬斌, 朱 偉

(青島農業大學 生命科學學院, 山東 青島 266109)

飼料粗蛋白含量對刺參消化酶及消化道結構的影響

吳永恒, 王秋月, 馮政夫, 李彬斌, 朱 偉

(青島農業大學 生命科學學院, 山東 青島 266109)

本實驗以魚粉、酪蛋白以及藻粉等為主要原料配制了粗蛋白質量分數為12%、16%、20%、24%、28%、32%的6種半精制刺參(Apostichopus japonicus)飼料, 研究飼料中粗蛋白含量對刺參生長、蛋白酶和淀粉酶活性以及腸道結構的影響。結果表明, 刺參飼料中粗蛋白含量對刺參的生長、飼料系數、蛋白質效率以及消化道中蛋白酶和淀粉酶活性都有明顯影響, 腸道蛋白酶和淀粉酶活性對飼料粗蛋白含量有適應性, 隨飼養時間也有適應性變化。飼料中粗蛋白含量對刺參腸道結構也有一定的影響。

刺參(Apostichopus japonicus); 粗蛋白; 蛋白酶; 淀粉酶

蛋白質是水產動物重要的營養物質, 水產動物的生長速度與其所攝食飼料的粗蛋白含量有密切關系, 而對消化酶活性的研究有助于更準確地掌握水產動物對飼料中蛋白質的需求量, 并且更有助于探討飼料中粗蛋白含量與消化酶活性的關系。

對刺參(Apostichopus japonicus)蛋白質營養及消化生理的研究尚處于初步階段。朱偉等[1]通過飼養實驗確定了刺參稚參飼料中的最適粗蛋白含量為18.21%～24.18%, 粗脂肪的適宜含量為 3%～5%, 為刺參人工配合飼料的研究提供了理論依據。刺參體內存在多種蛋白酶, 不同部位蛋白酶的活性也有所差異, 且隨著季節而變化, 尤其水溫的變化, 刺參的消化道形態和消化道內消化酶的活性有顯著的變化,夏季刺參進入“夏眠”之后, 消化道變短、薄而細, 消化酶活性下降[2-3]。不同發育階段刺參蛋白酶的活性也存在較大差異, 且蛋白酶活性與淀粉酶活性的比值反映出其食性的轉換[4]。刺參的食性在發育過程中是不斷變化的, 對刺參蛋白酶和淀粉酶活性隨飼料中營養含量變化的研究有助于觀察刺參對飼料中營養物質的消化吸收情況及其對營養物質的需求狀況。作者對刺參消化道內的蛋白酶和淀粉酶活性與飼料中粗蛋白含量及刺參生長情況的關系進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗飼料以魚粉、酪蛋白、酵母粉、馬尾藻粉、麥麩、精煉魚油、混合礦物質與混合維生素等為原料配制。以酪蛋白調節飼料中粗蛋白的含量, 共設計了6個粗蛋白水平, 分別為12%、16%、20%、24%、28%、32%, 見表1。將飼料原料混勻后加適量水攪拌, 經擠條機制成1.5 mm細條, 在60℃條件下烘干,至水分為 8.92%～9.15%, 然后粉碎成 120目顆粒待用。

1.2 飼養實驗

實驗在山東省青島市平度養殖實驗基地進行。實驗用刺參平均體質量 2.5g。海水鹽度為 30‰, 水溫為 16℃±1℃。飼養期間連續充氣, 水溫控制在17℃±0.5℃, pH 7.8～8.2, 溶解氧不低于 5 mg/L,NH4+的質量濃度為0.038～0.070 mg/L。

實驗刺參共分為 6組, 每組投喂不同粗蛋白含量的飼料, 在養殖期間收集糞便, 每 10天隨機抽取實驗海參8頭測定刺參體內蛋白酶、淀粉酶活性。

1.3 生長指標的測定

增重率(%) = 凈增重/試驗初重×100%;

飼料系數 = 攝食量/凈增重;

蛋白質效率 = 總增重/(攝食量×飼料蛋白質量分數%);

蛋白質利用率(%) = 飼料中蛋白質的量－糞便中蛋白質的量/飼料中粗蛋白的量×100%。

表1 實驗基礎飼料配方及營養成分Tab. 1 The formulation and nutritional composition of experimental diets

1.4 消化酶活性的測定

刺參取樣前, 停食48 h, 使其排空消化道內的食物殘渣, 將其放于冰盤內用剪刀沿刺參腹部剪開, 取出消化道, 剔除生殖腺及與消化道末端相連的呼吸樹, 用濾紙吸去表面水分, 稱重后加入10倍體積預冷的去離子水, 在冰浴條件下用高速勻漿機勻漿 10 min, 然后將勻漿液于高速冷凍離心機中(4℃, 10 000 r/min)低溫離心30 min, 上清液即為粗酶液。

淀粉酶活性測定采用淀粉-碘顯色法[5]。向試管中加入0.04%可溶性淀粉5 mL, 于37℃水浴中預熱5 min, 加入粗酶液1.0 mL, 充分混勻后, 37℃水浴反應7.5 min, 再加入0.01 mol/L碘應用液5.0 mL終止反應, 然后稀釋到50 mL立即充分混勻, 660 nm處比色?？瞻字胁患用敢? 其他同測定管。淀粉酶活力單位定義為：pH為7.0, 在(37 ± 1)℃條件下保溫30 min,100 mL酶液中的淀粉酶完全水解淀粉10 mg為一個淀粉酶活力單位。

蛋白酶活性采用福林-酚試劑法[6]。向試管中加入0.5%的酪蛋白溶液2.0 mL和pH7.2的磷酸緩沖液4.0 mL, 在40℃下保溫5 min, 然后加入粗酶液1.0 mL, 保溫20min, 立即加入10%三氯乙酸2.0 mL終止反應。取出常溫離心(3 000 r/min)10 min后的上清液1 mL, 加入0.4 mol/L的碳酸鈉溶液5.0 mL, 再加入1.0 mol/l的福林試劑1.0 mL, 于40℃恒溫水浴中顯色20 min, 然后在680 nm波長下比色測定, 對照管在加入粗酶液前加入三氯乙酸使酶失活, 其他同測定管。蛋白酶活力單位定義：在 pH7.2和 40℃下保溫20 min, 1 g刺參消化道1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸即為1個蛋白酶活力單位。

1.5 組織切片的制作

將實驗刺參停食 24 h, 使其排空消化道內的食物殘渣, 沿腹中線的右側解剖, 剔除與消化道末端相連的呼吸樹。將腸道組織固定于Bouin’s液中, 常規石蠟連續切片, 切片厚度 5～7μm, H. E染色,Olympus顯微鏡觀察、拍照。

2 結果

2.1 飼料粗蛋白含量對刺參生長及體成分的影響

2.1.1 飼料粗蛋白含量對刺參增重率及體成分的影響

由表2可見, 實驗刺參的增重率隨飼料中粗蛋白含量的變化而變化。在飼料中粗蛋白質量分數為16%、20%和 24%時, 增重率為分別為 101.98%,98.99%和 88.53%, 三者之間沒有明顯差異, 但明顯高于粗蛋白質量分數為12%的處理(P＜ 0.05), 而當飼料中粗蛋白含量繼續增加時, 實驗刺參的增重率則下降, 當飼料粗蛋白質量分數為 28%和 32%時,增重率僅為60.40%和59.62%, 下降的幅度較大。實驗刺參體內粗蛋白質量分數為 36.70%～38.39%, 各處理間差異不顯著(P＞ 0.05); 粗灰分質量分數在40%～42%之間, 水分在 92%～93%之間, 各處理間差異均不顯著(P＞ 0.05)。說明飼料中粗蛋白含量對刺參體內粗蛋白、粗灰分和水分含量沒有明顯影響。實驗刺參體內粗脂肪質量分數在 4.7%～6.7%之間,但飼料粗蛋白從 12%到 28%時, 體內粗脂肪含量有下降的趨勢, 詳見表3。

表2 粗蛋白含量的飼料對刺參幼參生長的影響Tab. 2 Growth performance of Apostichopus japonicas fed the diets containing different protein levels

表3 不同蛋白含量飼料飼養后刺參體成分Tab. 3 Nutritional Compositions of Apostichopus japonicas with different protein level of experimental diets

2.1.2 不同粗蛋白含量飼料飼養下的飼料系數及蛋白質效率

在飼料中粗蛋白含量為16%、20%和24%時, 飼料系數分別為0.54, 0.55和0.59, 三者之間無明顯差異, 都明顯低于其余各處理。當飼料中粗蛋白含量進一步增加時, 飼料系數隨之上升。蛋白質效率隨粗蛋白含量的變化趨勢非常明顯, 各處理之間的蛋白質效率有顯著差異(P＜ 0.05)。12%與16%處理的蛋白質效率分別為 12.57%和 11.98%, 無顯著差異(P＞0.05), 但隨著飼料中粗蛋白含量的增加, 顯著下降(P＜ 0.05)。

2.2 飼料中粗蛋白含量對刺參腸道蛋白酶和淀粉酶活性的影響

由圖1和圖2可以看出, 實驗刺參消化道內蛋白酶和淀粉酶的活性明顯受到飼料中粗蛋白含量的影響。當飼料中粗蛋白含量由12%增加到16%時, 實驗刺參消化道蛋白酶活性明顯升高, 由11.64 μg/(g·min)升高到16.02 μg/(g·min)。飼料中粗蛋白含量從16%升高到 24%過程中, 蛋白酶活性無明顯變化, 為16.02～18.82 μg/(g·min)。之后, 隨著飼料中粗蛋白含量的提高, 蛋白酶活性明顯上升, 在飼料粗蛋白含量為 28%時達到最大值, 為 24.71 μg/(g·min)。這說明刺參對飼料中粗蛋白含量具有明顯的適應性。實驗刺參消化道內淀粉酶的活性也隨著飼料中粗蛋白含量的升高, 呈明顯上升的趨勢。當飼料中粗蛋白含量為12%時, 淀粉酶活性為138.51 mg/(g·min), 當飼料粗蛋白達到 32%時, 淀粉酶活性達到最大值, 為218.38 mg/(g·min)。

圖1 粗蛋白含量對刺參蛋白酶活性的影響Fig.1 Effect of crude protein on protease activity in sea cucumbers

圖2 粗蛋白含量對刺參淀粉酶活性的影響Fig.2 Effect of crude protein on amylase activity in sea cucumbers

刺參消化道蛋白酶活性隨飼養時間的變化見圖3。由圖中可見, 各個處理實驗刺參的消化道蛋白酶活性在飼養實驗過程中的變化基本一致。在飼養實驗的前10天, 實驗刺參消化道內蛋白酶活性都呈現明顯的上升趨勢, 之后又逐漸降低, 并在飼養實驗進行到 20天時降到最低, 而后略有回升, 并在飼養實驗進行至40天的過程中保持比較平穩的水平。在飼養實驗 40天至 56天過程中, 蛋白酶活性略有上升。各處理中, 飼料粗蛋白含量為 16%處理的腸道內蛋白酶活性變化幅度最小。由圖4可見, 各組實驗刺參之間淀粉酶在飼養實驗進行中的變化趨勢也基本相同。與蛋白酶的變化趨勢所不同的是, 在飼養實驗初期, 實驗刺參消化道內淀粉酶活性明顯降低, 并于飼養實驗10天時達到淀粉酶活性最低。之后淀粉酶活性顯著升高, 并在之后的飼養實驗過程中保持相對平穩的變化趨勢。飼料中粗蛋白含量16%的實驗刺參的淀粉酶活性在飼養實驗中變化幅度最小。

2.3 飼料粗蛋白含量對刺參消化道組織結構的影響

刺參的消化道管壁分為 4層：由內到外依次為黏膜層、黏膜下層、肌肉層和漿膜層(圖5)[7]。從圖5中可以看出, 前腸結締組織薄, 腸絨毛長, 肌肉層也較薄。粗蛋白含量為 12%和 16%的刺參消化道的組織各層結構清晰, 黏膜細胞排列整齊, 前中后腸的組織結構在這兩個處理中沒有顯著差異。但 32%粗蛋白含量的處理中中腸外層細胞和黏膜細胞輪廓不清晰, 說明組織結構受到影響(圖5-C2)。

圖3 刺參蛋白酶活性隨養殖時間的變化Fig. 3 The change of protease activity during feeding

圖4 刺參淀粉酶活性隨養殖時間的變化Fig. 4 The change of amylase activity during feeding

3 討論

從本實驗的結果看, 刺參在飼料粗蛋白為 16%時即達到最大的生長速度, 而一直到粗蛋白含量為 24%時, 實驗刺參的增重率都維持在最高水平(P＜0.05),從飼料效率來看, 飼料粗蛋白在 16%～24%時, 其飼料系數最低, 飼料蛋白質效率最高, 說明飼料粗蛋白的適宜含量為 16%～24%。朱偉等[1]的研究認為, 刺參飼料的粗蛋白的適宜含量為18.21%～ 24.18%, 與本實驗的結果基本一致。當飼料中粗蛋白含量高于24%時, 隨著飼料中粗蛋白含量的上升, 刺參增重率逐漸下降,表明過高的粗蛋白不利于刺參的生長。在其他動物如羅非魚[8]和凡納濱對蝦[9]中也有相同現象。

從圖1和圖2可以看出刺參攝食不同粗蛋白含量的飼料其消化道蛋白酶活性變化趨勢。當刺參攝食不同粗蛋白含量的飼料后, 能夠通過體內消化酶活性的變化來適應, 從而對飼料中粗蛋白進行更充分的消化和吸收, 因此可以認為刺參消化道內蛋白酶活性對飼料中粗蛋白含量有適應性變化, 即當飼料中粗蛋白含量高時, 刺參的消化道內的蛋白酶活性會隨之增大。而且, 這種適應性不僅存在于低于刺參飼料粗蛋白最適含量(16%～24%)時, 而當飼料中粗蛋白含量高于 24%時, 也有此變化, 但此時雖然刺參腸道蛋白酶活性提高, 而增重率卻沒有相應地增加。羅氏沼蝦消化酶活性對飼料蛋白質含量有適應性反應, 飼料蛋白含量的增加, 可顯著影響羅氏沼蝦稚蝦類胰蛋白酶和胃蛋白酶的活性, 但不影響淀粉酶的活性[10]。這與羅氏沼蝦蛋白酶活性與飼料蛋白含量關系的研究所得結論相一致,可能的原因是隨著飼料中粗蛋白含量的提高使蛋白酶活性升高, 吸收到體內的蛋白質隨之增加, 但過多的蛋白質不能用來合成自身組織而是被自身代謝而被消耗。當飼料中粗蛋白含量超過 28%時, 刺參腸道內蛋白酶活性隨飼料中粗蛋白含量的提高而有所下降。在對寶石鱸、南方鲇中的研究中也發現了同樣的現象[11-12], 這可能與消化道內蛋白酶活性的產物抑制作用有關, 還有待進一步研究。因此, 在配合飼料的研制過程中應考慮使飼料的粗蛋白含量與刺參自身的消化酶活性相適應, 以降低養殖成本, 提高飼料中蛋白質利用率。

刺參腸道內淀粉酶活性隨飼料中粗蛋白含量的增加(碳水化合物含量減少)而逐漸升高。當飼料中粗蛋白含量為 32%時淀粉酶活性達到最大值。說明刺參淀粉酶活性對飼料中淀粉含量的適應程度較低。這一結果與羅氏沼蝦, 中國對蝦淀粉酶與飼料粗蛋白含量關系的研究中所得的結果相似[13]。

圖5 實驗刺參腸道橫切Fig. 5 Transverse sections of sea cucumbers

在飼養實驗過程中, 刺參腸道內消化酶活性的變化分為兩個階段。在第一個階段(前 20d), 刺參蛋白酶活性呈現顯著的先上升后下降的趨勢, 淀粉酶活性呈現先下降后上升的趨勢。兩種消化酶活性都出現了較大幅度的變化, 但變化趨勢截然相反, 這種現象可能與刺參對實驗飼料的適應性有關。這與對中國對蝦的研究得到的結論一致, 中國對蝦體內消化酶活性的急劇變化與飼料改變后導致消化系統活動的應激作用有關。隨著飼養時間的延長, 機體內消化酶的分泌量受其神經內分泌因素的調控, 與機體的新陳代謝水平逐漸相適應。本實驗結果說明, 消化酶分泌量多少與活性的大小不僅與消化系統自身有關, 還與機體的整體代謝的調控水平相適應。在第二階段(20 d后), 刺參對攝食的飼料逐漸適應, 消化酶活性變化趨于平穩。在該階段, 蛋白酶活性在經歷一個相對平穩期之后逐漸升高。飼料中粗蛋白質量分數 16%處理的實驗刺參消化道內蛋白酶、淀粉酶活性在飼養實驗過程中的變化最為平穩, 說明適宜的飼料粗蛋白含量引起的刺參體內的生理變化也最小。

作者選取了 12%、16%和 32%粗蛋白處理的刺參的橫切面圖進行了比較, 發現粗蛋白含量的變化引起的刺參腸道的組織結構的變化不大。尤其是在12%和16%中處理中前腸、中腸和后腸的組織結構均沒有顯著變化, 只是在 32%粗蛋白的處理中實驗刺參中腸的外層細胞和黏膜細胞的輪廓模糊, 說明其結構收到了影響, 但其中的原因還有待進一步分析,也不能排除替代粗蛋白的飼料原料增加而造成的。有研究表明, 刺參消化管的長度和質量的季節變化與刺參消化道中蛋白酶、淀粉酶等主要消化酶活性的周年變化是一致的, 既當刺參攝食旺盛, 消化酶活性高時, 其消化管較長、較重; 反之, 在攝食和生長緩慢的時期, 消化道內各種酶活性低, 消化管較短、較輕[3]。由此推測, 飼料的營養成分和原料組成都會影響消化道的結構。

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The effect of dietary protein on the enzymes and intestinal structure ofApostichopus japonicus

WU Yong-heng, WANG Qiu-yue, FENG Zheng-fu, LI Bin-bin, ZHU Wei
(Life Science College, Qingdao Agriculture University, Qingdao 266109, China)

Feb., 26, 2011

sea cucumber (Apostichopus japonicus); crude protein; protease; amylase

To investigate the effect of dietary crude protein levels on the growth, protease or amylase activity, and the intestinal structure ofApostichopus japonicus, a feeding experiment was conducted with six semi-purified diets with protein content of 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, and 32%. The results showed that growth performance, protease or amylase activity and the intestinal structure of sea cucumbers were significantly affected by dietary protein content. Intestinal protease or amylase activity could not only adapt for the diet crude protein, but also changed as feeding time. The histology observation showed that the mid-intestinal structure was affected by dietary content of crude protein.

S963.16; S986.2 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2012)01-0036-06

2011-02-26;

2011-05-12

青島市科技計劃資助項目(05-1-HY-79)

吳永恒(1985-), 男, 山東青州人, 碩士研究生, 研究方向為水產動物營養生理; 朱偉, 通信作者, 教授, 研究方向為水產動物營養與飼料, 電話：0532-86080640, E-mail：zhuw001@163.com

梁德海)