微藻的異養培養及應用研究

張 帆, 韓笑天, 李巋然, 冀曉青

(1. 中國海洋大學 海洋生命學院, 山東 青島, 266003; 2. 中國科學院 海洋研究所 海洋生態與環境科學重點實驗室, 山東 青島, 266071)

微藻的異養培養及應用研究

Heterotrophic culture of microalgae and application

張 帆1,2, 韓笑天2, 李巋然1, 冀曉青2

(1. 中國海洋大學 海洋生命學院, 山東 青島, 266003; 2. 中國科學院 海洋研究所 海洋生態與環境科學重點實驗室, 山東 青島, 266071)

微藻(microalgae)是一大類微觀的以個體、鏈狀或群體形式存在的單細胞藻類, 大小從幾微米到幾百微米不等。微藻種類繁多, 據估計大約有200 000～800 000種, 其中已有記錄的有35 000多種[1]。自20世紀60年代起, 日本首先開始進行商業化大規模的微藻培養[2], 至今人們已經能夠在保健食品、醫藥原料、美容、飼料等多種領域實現微藻的商業化生產[3]。目前, 微藻的大規模商業化培養主要限于在光生物反應器中進行, 具有占地面積大、生產周期長、藻類生長密度較低等缺陷, 變相增加了生產的成本, 限制了微藻培養的發展。尋找一種高密度、低成本培養微藻的方法, 對微藻培養產業化的進一步發展極為重要。

1953年, Lewin等[4]首先發現了一些藻類能利用有機物作為唯一碳源和能源進行異養生長, 由此拉開了微藻異養培養研究的序幕。利用工業發酵方法異養培養微藻, 可以節省空間, 提高產量, 避免雜藻和細菌的污染, 且培養條件容易控制, 是微藻大規模產業化生產的發展趨勢, 國內外對此的研究也越來越多。

1 微藻的異養方式和機理

(Anabaena variabilisATCC29413)[7]等也可以進行化能異養生長。

(2)光異養生長(Photoheterotrophy)是在光照強度不足以支持光合自養生長的低光照下, 利用有機碳進行異養生長。例如, 微芒藻(Micratinium pusillum)能夠在 8 μmol/(m2·s)的光照條件下, 利用乙酸鈉作為碳源進行異養生長[8]。另一種途徑是在含有機碳源的培養基中加入一定濃度的二氯苯基二甲基脲(dichlorophenyl dimethylures, DCMU), 此時細胞光系統Ⅱ的活性被抑制, 光和自養生長不再進行, 但光系統I仍在起作用, 細胞仍可通過環式磷酸化進行ATP的合成, 進行異養生長。如隱球藻(Aphanocapsasp.)在濃度為10-5mol/L 的DCMU中, 弱光照條件下培養, 可以進行異養生長[9]。

(3)光激活異養生長(Light-activated heterotrophic growth, LAHG)是對藻細胞每天施以不足以支持其光合自養生長的脈沖式短暫光照, 此時的光并沒有被當做能源利用, 而是起到一種調控作用。如集胞藻(Synechocystissp., PCC6803)在每天5～10 min 40μmol/(m2·s)的光照條件下, 能夠利用葡萄糖進行異養生長。此時光作為一種環境信號在代謝或基因水平上調控著集胞藻的異養代謝和細胞分裂, 而其異養生長的碳源及能源仍然來源于有機物[10]。

1.1 微藻的異養生長方式

異養是利用有機碳源作為碳源和能源, 進行的需氧發酵生長。微藻的異養方式主要可以分為3類[5]：(1)化能異養生長(chemoheterotrophy) 是在完全黑暗條件下利用有機碳進行異養生長。例如, 寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)是一種海洋異養型微藻,

培養過程中不需要光照, 細胞可利用培養基中的有機物質來進行細胞的生長和分裂[6]。異形魚腥藻

1.2 限制微藻異養生長的機理

不是所有微藻都可以進行異養生長。導致微藻不能利用有機碳進行異養生長的原因可能有多種,不同微藻之間其異養機理也有所差異。目前關于微藻的異養生長機理的研究還不夠深入。Lewin[4]最早提出雖然一種藻類可能會擁有代謝某些有機物的能力, 但所產生的能量和中間產物并不一定是生長所必需的。Gladue[11]針對某些微藻不能異養生長總結了3種假說。Kelly[12], Rittenberg[13]等對限制微藻異養生長的原因也分別提出了假說。這些假說主要包括以下方面：

(1) 缺乏合適的利用有機碳的機制

通透性障礙：細胞膜的通透性可以影響有機碳的吸收。小分子可以通過直接擴散進入細胞, 但大部分可以作為有異養生長碳源的有機碳分子比較大,需要一定的攝入機制才能進入所培養微藻的細胞內部。一些藻類缺乏吸收某些有機碳的機制, 必然導致其無法利用相應的有機碳[14]?？梢酝ㄟ^選取合適的碳源或者人為改變微藻對特定碳源的吸收能力來解決這一問題。例如, 三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是一種只能進行自養培養的微藻, 將一種能編碼葡萄糖傳遞蛋白的基因引入到該微藻后, 即實現了三角褐指藻的異養培養[15]。

相關酶的缺乏：與有機碳分解相關的酶系統可以影響有機碳的利用。一些微藻不能進行異養生長的原因即在于缺乏利用某些有機碳的酶, 不能分解來合成自身物質[14]。例如, 在硫桿菌的培養中, 由于一些關鍵酶不能利用, 導致三羧酸循環不完整, 使其不能進行異養生長[16]。微藻利用有機碳的相關酶類可以是自身固有或者是經誘導產生的。缺乏針對利用某一種有機碳的酶類, 并不說明該微藻就不能進行異養生長, 還可以嘗試用其他的有機碳源進行培養。

(2)利用有機碳產能及中間產物的影響

限制性呼吸能力：微藻生長的能量來自于呼吸作用分解自身儲藏物所產生的能。但是, 在異養條件下, 某些藻類的有機底物氧化與ATP合成不偶聯[17],呼吸所產的能量不足以維持其基本的生理功能及生長需要, 無法持續地從外界獲取有機物質, 導致異養生長不能繼續。

代謝產物的影響：有機碳代謝的產物可以通過多種途徑對微藻的異養生長產生影響。某些代謝產物可以通過轉錄調控影響與其代謝相關的酶活性,從而影響自身的代謝。在代謝過程中, 也可能會產生有毒的物質, 抑制了微藻的生長, 如某些藍藻在利用甘油進行異養生長的過程中, 會產生致死劑量的甲基乙二醛(methyl glyoxal), 因此無法進行異養培養[18]。

2 可異養微藻種類

Lewin[4]早在1953年即對42株無菌培養的硅藻進行篩選, 并確定有4種13個株系可以進行異養生長。Gladue等[19]對可作為水產養殖飼料的部分微藻進行了異養篩選。此外, Van Baalen[20], Mannan等[7]也報道了藍藻中一些可以進行異養生長的種類。至今為止, 已經有多個門類幾十種微藻被篩選出來,部分種類如小球藻(Chlorella protothecoides)[21]已經得到較為深入的研究并達到較高產量。表1總結了一些可以進行異養培養的藻種。

3 影響微藻異養生長及產物的因素

3.1 營養條件對異養生長及產物的影響

碳源是微藻異養生長最為重要的影響因素, 是微藻細胞的能量來源和主要組成部分。選擇合適的碳源, 對能否進行異養培養及培養產量和產物組成起著極為關鍵的作用。不同藻類對碳源的需求不同,目前應用最廣泛的碳源為葡萄糖, 新的更加經濟的碳源的研究也在不斷進行中。劉世名等[39]使用 6種不同的碳源異養培養小球藻, 加入葡萄糖的一組在前期和中期生長速率最高, 加入果糖的一組在后期略高于葡萄糖。采用玉米淀粉經雙酶法制得的酶解糖異養培養小球藻(Chlorella vulgaris), 平均生物量可達 46.8 g/L, 大大超過葡萄糖作為碳源時的產量[40]。最新研究表明, 酶解的甜高粱漿可以作為碳源異養培養小球藻(C. protothecoides), 其細胞干質量與含油量可分別達到 5.1g/L和 52.5%, 細胞干質量比同等條件下使用葡萄糖作為碳源高出35.7%[41]。

氮是微藻生長必需的另一基本營養元素, 可分為單一氮源和復合氮源兩大類。單一氮源包括硝酸鹽和尿素等, 可以支持部分種類微藻的生長與所需產物合成。復雜氮源包括酵母浸出粉、蛋白胨、玉米漿等, 可以支持大部分微藻的異養生長。通常復雜氮源比單一氮源更有利于微藻的異養生長, 因為復雜氮源同時提供氨基酸、維生素、生長因子等。用低氮濃度的培養基培養, 可以使微藻內脂質含量增加[42], 然而, 盡管隨硝酸鹽濃度的增加, 微藻中脂肪酸含量呈下降趨勢, 但總生物量上升, 使得單位水體內的脂肪酸含量還是上升的[43]。

表1 可異養藻種

海洋浮游生物的C、N、P具有一個特定的組成,即Redfield比率, 其值為106C：16N：1P, 這一比率受到海洋浮游植物和海洋環境相互作用的調節[44]。C/N可以通過控制蛋白質和脂質的轉換影響細胞內脂類的含量[45]。Chen等[46]發現, 在異養培養小球藻(C.sorokiniana)的實驗中, C/N比在20左右時為氮限制和碳限制的轉換點, 在此點培養時, 細胞內脂質含量達到最小值, 高于或低于此值, 細胞內脂質含量均增加。張麗君等[47]異養培養小球藻(C. vulgaris)的最優C/N為4～5, 在此條件下培養, 其蛋白質含量可達30%, 葉綠素含量為1.2%。

磷是核酸和細胞膜的重要組分, 在細胞的能量轉換中起到重要作用。培養基中的磷源一般以正磷酸鹽的形式存在。微藻細胞中的PUFAs主要是以極性脂肪酸(如磷脂)的形式存在, 因此其含量受磷含量的影響顯著[48]。磷對微藻生物量和產物的影響在不同藻類之間變化。在磷不足的情況下, 異養培養雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis), 其生物量為3.5 g/L,蝦青素(astaxanthin)的產量15 mg/g, 均達到較高的水平[49]。對于三角褐指藻, 培養基中磷酸鹽質量濃度大于0.5 g/L時, 即不能生長; 0.05～0.5g/L范圍內,對生物量影響不大; 0.1～0.5g/L范圍內, 其EPA 達到最佳水平[50]。

硅是硅藻生長所需的重要元素。硅藻的細胞壁主要由硅質元素沉積構成。某些海洋硅藻的油脂含量會隨著培養基中硅鹽的減少而呈增加趨勢[51]。同樣, 當硅成為限制因子時, 菱形藻(Nitzschia laevis)中EPA 的含量也會增加[42]。出現此類現象是由于在硅限制的培養中, 硅藻細胞更傾向于改變新陳代謝,將之前消耗于硅鹽的能量轉化成油脂儲存[52]。

金屬離子、維生素和其他生長因子對微藻的異養生長也有一定的影響作用。在一定濃度范圍內, 隨硒濃度的增加, 異養小球藻(C. vulgaris)的生物量、蛋白質、葉綠素a和類胡蘿卜素含量均呈上升趨勢,至20 mg/L時達到最大值, 隨后開始下降, 而可溶性糖、維生素C、葉綠素b的含量均呈顯著下降趨勢。當用超過25 mg/L的硒濃度去處理異養小球藻時,各生理指標均表現為大幅度降低[53]。質量濃度0.1～100 mg/L的 La(NO3)3均能促進小球藻(C. vulgaris)的異養生長, 在10 mg/L時達到最大值, La3+還能促進其對葡萄糖的吸收, 提高其葉綠素含量[54]。當小球藻(C.vulgaris)到達指數生長后期時, 向培養基中補加Fe3+,可延長指數生長期, 提高細胞終密度。高濃度的鐵對小球藻的生長有輕微的抑制作用, 但卻顯著地促進其油脂的積累[55]。當VB12的加量為10-5g/L時, 寇氏隱甲藻(C. cohnnii)生物量及細胞油脂產量均達到最大, 再增加VB12濃度時, 所受影響不大。而隨著生物素添加量的增大, 隱甲藻生物量增大, 但當生物素添加量大于 10-4g/L時, 其生物量下降; 當生物素添加量為 10-4g/L時, 隱甲藻油脂的產量達到最大[6]。植物生長物質 PP333, 能抑制異養小球藻生長的同時顯著提高其蛋白質含量[56]。植物生長抑制劑(+)ABA及與其相似的免疫球蛋白anti-ABBP Pabs可以促進小球藻的異養生長, 同時藻體總蛋白含量降低[57]。

3.2 環境因子對異養生長及產物的影響

溫度是控制微藻生長速度及產物組成的重要環境因子。Payer等[58]的調查顯示, 在所調查的 34種藻中, 有些能在很大溫度范圍內生長, 有些只在特定溫度生長。Miao等[59]在28℃±1℃異養培養小球藻(C. protothecoides)生產生物柴油, 得到較高的產量。通常, 低溫會抑制微藻生物量的增加, 但可以促進微藻中一些物質如脂類、多不飽和脂肪酸(PUFAs)、類胡蘿卜素等的積累。但并不是所有藻類在這二者上都不一致, 淡色紫球藻(Porphyridium purpureum)即在同一溫度獲得較高生物量和EPA含量[60]。因此,對于不同的藻及所需產物, 需要確定不同的培養溫度。對于高溫生長, 低溫累積所需產物的藻類, 可以采取變溫的培養方式, 以達到提高產率的目的[61]。

鹽度可以影響到微藻的生理特性, 調節細胞內外的滲透壓。NaCl會不同程度地抑制小球藻(C.vulgaris)的生長, 且濃度越高, 抑制越明顯。在濃度為0.1～0.4mol/L的NaCl培養基中, 藻細胞的生物量減少量不大, 但是脂肪酸含量比未添加NaCl的有了明顯的提高, 當NaCl質量濃度為0.3 mol/L時得到最高脂肪酸總產量 1.04 g/L[62]?？苁想[甲藻(C.cohnnii)在 NaCl濃度 0.2%～2.3%的范圍內, 隨著NaCl濃度的增大, 其最終的細胞生物量增大, 但在大于0.9%之后增幅不明顯, 細胞中的油脂含量升高,在大于1.8%后趨于平穩, 油脂中DHA含量先增后減,在0.9%時達到最高[6]。

pH在呼吸作用中影響微藻對有機碳源的利用效率, 并影響培養基中微藻細胞對離子的吸收和利用,以及代謝產物的再利用和毒性[63]。不同微藻最適pH不同, 有些微藻在培養過程中可以將一定范圍的 pH調整到自己的最適值, 如小球藻(C. vulgaris)在初始pH為5.0～9.0時, 穩定期pH與生物量差別不大, 低pH時, 脂肪酸總量較大[62]。pH6～7之間, 是其取得高生長率和脂類產率的最適區間[39,47]。

溶氧濃度過低, 微藻的生長受到抑制。在小球藻(C. vulgaris)的發酵培養中, 通氣量為 8vvm以上時,微藻生物量得到顯著提高[40]。溶氧還能影響異養微藻產物及其組成。異養培養小球藻(C. sorokiniana)時, 通氣可以明顯增加微藻的生長、脂肪酸含量及不飽和脂肪酸的比例, 但細胞的總油脂含量降低[46]。而對于隱甲藻來說, 增加溶氧量可以使其細胞生長、油脂和DHA積累均呈上升趨勢[6]。

4 微藻異養培養的應用

4.1 生物柴油

隨著人類對能源日益增加的需求和化石能源的短缺, 尋找一種能替代化石燃料的可再生能源已經成為全人類的共同課題。生物柴油即是一種較為理想的可再生清潔能源。微藻油脂的主要成分為甘油三酸酯, 是制備生物柴油理想原料。目前微藻生物柴油已經成為國內外的研究熱點, 相比較由含油作物及動物脂肪中提取的生物柴油, 利用高效微藻生產的第二代生物柴油具有不可比擬的優勢：周期短,占地少, 可以利用海水及工業廢水, 全年均可生產。Miao等[21]提出從培養到提純的一系列方法, 說明從異養微藻中提取高品質生物柴油是切實可行的。許多研究也表明異養培養可以增加微藻產量及含油量,如小球藻(C. protothecoides)、寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnni)在異養條件下, 其細胞干質量與含油量均有一定程度的上升[41,6]。Chisti[64]認為, 基于環境、油脂質量、可能產量等多方面因素,一旦成本降低, 微藻生物柴油可能會成為唯一能滿足全球運輸需要的可再生能源。異養培養微藻可以進一步提高產量及油脂含量, 與自養培養相結合,在控制和降低成本的前提下, 可以促進微藻生物柴油的發展。

4.2 高附加值產物

多不飽和脂肪酸(PUFAs)對人體機能的調控起著重要的作用, 同時可以防治多種疾病。人體本身缺乏合成PUFAs 的酶, 只能從外界攝取PUFAs。EPA和DHA是兩種重要的PUFAs, 研究表明, 利用不同微藻可以分別生產質量穩定, 純度較高的EPA和DHA,在合適的異養條件下, 其產率也有所提升[65-66]。

類胡蘿卜素是一類天然的脂溶性色素, 可以淬滅單線態氧, 清除自由基, 在防治癌癥和免疫調節方面也有很高的活性[67]。蝦青素和葉黃素兩類重要的類胡蘿卜素, 在國際市場上價格高昂, 開發前景廣闊。異養培養小球藻(C. zofingiensis),蝦青素產量可以達到12.6 mg/L; 而對于小球藻(C. pyrenoidosa)的異養化高密度培養, 可以使葉黃素實現 249.4mg/L的產量和1.65mg/L/h的產率[68]。

4.3 餌料及飼料添加劑

微藻中含有豐富的蛋白質、氨基酸、色素、多不飽和脂肪酸等, 營養全面, 是水產及農業養殖的理想原料。微藻可以作為水產經濟動物的餌料, 具有人工餌料不具備的在水體中的良好分散性和保型性。由于微藻中色素含量豐富, 還被用作大馬哈魚培養中的天然食品著色劑[69]。微藻用作動物養殖的飼料添加劑, 可以顯著改善養殖動物的生理特點和外觀[70], 如增強免疫力、增加體重、使皮毛更為健康有光澤等。早在20世紀50年代, 就有使用小球藻飼養幼小禽類的報道[71]。限制微藻在動物養殖方面應用的, 主要是其較低的產量和偏高的價格, 異養培養為解決這一問題提供了可能的方向。

4.4 其他應用

微藻可以作為生物反應器, 經過基因工程的改造后生產人們需要的特定高分子產物。利用真核微藻作為反應器, 可以直接獲得有活性的蛋白, 而且其培養體系比動物細胞更為廉價和抗污染[72]。某些可食用微藻作為反應器, 還為獲得蛋白的利用方式提供了一種新思路。通過異養方式培養轉基因微藻,將使微藻作為生物反應器的前景更加明朗。

Aslan等[73]的研究表明, 小球藻(C. vulgaris)可以有效去除廢水中的氮和磷。在異養培養微藻時, 可以加入一定比例的廢水作為微藻的氮源和磷源, 可以在降低成本的同時, 達到減少環境污染的目的。微藻中含有促進皮膚緊致和皮膚細胞增殖的活性物質,可以用于化妝品的開發制造; 一些種類的微藻如小椿藻(Characium polymorphum), 綠球藻(Chlorococcum oleofacens)的油脂成分與植物油類似, 可以替代由于耕地減少等原因價格不斷上漲的植物油供人們食用[74]。

5 總結與展望

關于微藻異養培養的研究方興未艾。相比傳統培養, 異養培養不再受光的限制, 為微藻的大規模高密度培養提供了可能性。迄今為止, 國內外學者已經在機理假說、異養藻種篩選、培養條件優化、產物應用等諸多方面進行了大量研究工作。然而, 由于異養研究相對起步較晚, 各方面還不夠成熟, 目前仍然還有很多方向亟待探索：

(1)關于異養機理包括碳源的吸收利用、異養的調控機制等的進一步研究。目前微藻的異養機理仍不明確, 對機理的進一步研究有助于理解微藻的異養模式, 為異養藻種的篩選和培養條件的優化選擇提供理論依據。

(2)可異養培養藻種的篩選馴化?？梢岳玫奈⒃宸N類眾多, 但目前只有一小部分種類可以進行異養培養?？梢酝ㄟ^擴大篩選規模、改變培養條件、誘變和基因重組等方法獲得更多可異養藻株。

(3)降低異養培養的成本。偏高的成本是工業化培養進展緩慢的一大原因, 可以通過適當改變培養方法降低成本。如在含有機碳的廢水中異養培養微藻, 或者吸收含有 CO2的廢氣結合適當的兼養培養,既能降低成本, 對環境治理也有重要意義。

(4)活性產物的開發利用。相比自養、異養培養條件下, 微藻的產物及相同產物的產量會有所變化。也可通過基因工程或改變培養條件, 人為促進所需產物的累積。

異養培養的探索與開發, 將促使微藻在更多領域得到應用。可以預見, 隨著理論研究的不斷深入和培養技術的不斷發展完善, 微藻異養培養的發展空間將會進一步增加, 為人們應對能源、環境、糧食等全球問題提供新的解決思路。

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Q175 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2012)01-0117-08

2011-06-10;

2011-09-12

國家重點基礎研究發展計劃項目(2011CB200901); 國家自然科學基金項目(30870247); 山東省科技發展計劃項目(2011GGF01074) ; 海洋公益性行業科研專項(200805039)

張帆(1984-), 女, 山東青島人, 碩士研究生, 主要從事海洋微藻的研究, E-mail：13658696600@163.com; 通信作者, 韓笑天,副研究員, E-mail：xthan@qdio.ac.cn

張培新)