Zn2+及Fe3+對嗜淀粉乳桿菌開放式發酵產乳酸的影響

鄒 惠,汪群慧,劉建國,王 爽(北京科技大學環境系,北京 100083)

乳酸是重要的生物化工產品,廣泛用于醫藥、食品、飲料、日用化工、化工、石油化工、皮革、卷煙工業等領域.其異構體合成的L-乳酸聚合物,可生產能生物降解的農用地膜及其他塑料制品,可有效解決全球的“白色污染”問題,因此,乳酸有廣闊的國內外市場[1].

嗜淀粉乳桿菌是一種具有淀粉水解活性的乳酸細菌,它產生的解淀粉酶具有淀粉酶和支鏈淀粉酶雙重活性,可以直接轉化復雜的淀粉質底物生成乳酸[2-4].餐廚垃圾是一種淀粉含量較高的有機廢物,其淀粉含量達到 41.38%～55.09%(按干重計),嗜淀粉乳桿菌的加入將有利于簡化糖化等生產工藝,故此類細菌在乳酸發酵工業上應用廣泛[5-7].傳統乳酸發酵方式采用滅菌式的非開放式發酵,這種發酵會消耗大量電能,采用不滅菌的開放式發酵是一種理想的發酵方式[8].目前微生物發酵過程中存在著產酸率低,微生物對原料的利用率低,容易累積產生其它非目標產物,生產周期長等問題.鋅離子、鐵離子等微量元素可影響細胞內關鍵性酶活,當底物中Zn2+濃度大于1.748mg/L或Fe3+的濃度達到0.204mg/L時,培養基中的乳酸菌生長良好,乳酸的積累量將大大增加[9-10].本課題組在前期實驗基礎上,采用在開放式發酵過程中引入代謝調控物的方法,研究微量元素對乳酸發酵的影響,旨在突破產酸量低的瓶頸.

1 材料與方法

1.1 菌種

嗜淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylophilus GV6),購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心.

1.2 餐廚垃圾

取自北京科技大學鴻博園食堂,挑去骨頭、塑料袋等不可降解物后,垃圾中主要包括米飯、蔬菜、肉、蛋、豆腐、面條等.保存于-20℃的冰箱內待用.其成分如表1所示(按干重計)

表1 餐廚垃圾成分表(%)Table 1 Composition of kitchen waste (%)

1.3 培養基

MRS培養基.121℃滅菌15min備用.

1.4 發酵方法

150g粉碎后的垃圾加入 75mL水,裝入500mL具塞玻璃瓶中(非開放式發酵在 121℃滅菌15min),通入高純氮氣生成厭氧環境,按接種量2g(菌體濕重)/L(餐廚垃圾培養基)接入嗜淀粉乳桿菌(菌齡24h),37℃下發酵96h.

1.5 分析方法

取樣后 4000 r/min離心 15min,上清液經0.45μm微孔濾膜過濾后測定.液相色譜選用日本島津公司高效液相色譜儀LC-20AT.

有機酸測定[11]為色譜柱:預柱 C185μm×26mm,分析柱 Inertsil ODS-SP 5um C186mm×250mm,檢測器UV 210nm,柱溫40℃,流動相超純水(pH值為2.5～3.0),流速0.8mL/min.糖濃度測定[12]:分析柱為 Inertsil NH25um 250mm× 4.6mm,檢測器示差檢測器,柱溫 40℃,流動相75%乙腈+25%超純水,流速1.0mL/min.采用峰面積外標法定量,得到各種濃度.乙醇含量的測定:利用 SBA-40C型生物傳感器進行測定.乙醇脫氫酶,乳酸脫氫酶測定[13]:乳酸脫氫酶是在催化丙酮酸轉化乳酸的同時,將NADH氧化成NAD,使得NADH在340nm處的吸光度不斷降低,因此連續測定酶反應過程中340nm處吸光度的變化即可算出酶活.酶活單位定義為25℃時,每min氧化1umol的NADH所需的酶量;而乙醇脫氫酶是把丙酮酸轉為乙醇的關鍵性酶活,其大小是在340nm處檢測 NAD+的還原速度.酶活力單位定義為每min催化1umolNAD+還原需要的酶量.酶活力的計算公式為

式中:VT為反應總體積,mL;VS為樣品體積,mL;△A為每min吸光度的降低值.

將樣品置于冰浴中,200W 功率超聲波破碎20min,10000r/min離心 15min,除去細胞殘片,即得到粗酶液.每個樣品取5個平行.

2 結果與討論

2.1 利用嗜淀粉乳桿菌開放式發酵餐廚垃圾產乳酸的可行性

在發酵 96h后,2種發酵體系的發酵液色譜圖極其相似,說明他們的組成相差不大多,主要為乳酸、乙酸、甲酸及酒石酸.在開放式發酵下,乳酸產量最高值22.8g/L,占總有機酸的87.2%,而非開放式發酵下乳酸最大值僅為14.8g/L,占總有機酸的 71.5%,較開放式發酵乳酸產量低得多.推測在開放式發酵中,垃圾中存在各種代謝類型的微生物,使淀粉、纖維素等大分子得到不同程度的降解,提高了發酵液中乳酸細菌可利用的小分子化合物的含量,從而使乳酸產量增加[14],而且開放式發酵不需滅菌,節省了大量能源,故以后的實驗均采用開放式發酵.

2.2 Zn2+及 Fe3+對開放式乳酸發酵中的相關酶活及代謝產物的影響

2.2.1 Zn2+及 Fe3+對發酵過程中乳酸產量的影響 在乳酸發酵過程中,乳酸菌經過糖酵解途徑(EMP)利用糖后產生中間產物丙酮酸,此后丙酮酸的代謝決定了終產物的不同.為了獲得高產量的乳酸,最理想的是丙酮酸在乳酸脫氫酶(LDH)的作用下產生乳酸,如反應式(1)所示,而在實際過程丙酮酸可能會在乙醇脫氫酶(ADH)的作用下被還原生成乙醇,如反應式(2)式(3)所示,也有可能產生丙酸,丁酸等副產物,因此為提高乳酸產率,需在提高乳酸脫氫酶活性的同時,控制副產物的生成,即降低乙醇脫氫酶等的活性[15].

分別在餐廚垃圾培養基中加入0.02m mol/L ZnSO4×7H2O,0.01mmol/L Fe2(SO4)3,考察 Zn2+, Fe3+對嗜淀粉乳桿菌開放式乳酸發酵的影響由圖1可見, Fe3+的添加乳酸產量高達29.5g/L,較添加 Zn2+及空白樣(添加任何微量元素)的乳酸產量提高了 48.3%,29.4%,且添加 Fe3+的乳酸發酵L-乳酸純度為90.1%,而添加Zn2+及空白樣的L-乳酸純度分別為 82.7%,84.5%,這表明 Fe3+能促進乳酸發酵,Zn2+卻相反.

圖1 三種發酵體系中乳酸產量隨發酵時間的變化Fig.1 The influence on lactic acid under different microelement

2.2.2 Zn2+及 Fe3+對乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶酶活的影響 Zn2+,Fe3+是維持很多酶和轉錄因子功能的微量元素.它們對細胞的生長、發育和分化起至關重要的作用.鋅離子主要作為細胞蛋白、核酸、碳水化合物和脂類的共因子存在,通過調節鋅離子可影響細胞反應.

從圖2可知,添加Zn2+在整個發酵過程中抑制了乳酸脫氫酶的活性,卻提高了乙醇脫氫酶的活性,且在 48h時,ADH活性達到最大值 10.75 U/mg;相反,添加 Fe3+卻抑制了乙醇脫氫酶的活性,提高了乳酸脫氫酶的活性,且在發酵進行 48h后達到最高值11.87 U/mg,這間接說明在體系中添加 Fe3+能加快嗜淀粉乳桿菌積累乳酸.兩種離子的添加造成不同的結果,原因是Zn2+不是LDH的激活劑卻是ADH的激活劑,故其提高ADH的活性,降低了LDH的活性[16].

圖2 三種發酵體系中LDH和ADH隨發酵時間的變化Fig.2 The influence on LDH and ADH of microelement

加 Zn2+體系中乙醇脫氫酶(ADH)活性的提高,導致了乙醇的含量的增加(圖3和圖2b),而加Fe3+體系卻相反,它增加了乳酸脫氫酶(LDH)的活性而提高了乳酸的產量(圖1和圖2a).

圖3 不同微量元素條件下乙醇含量隨發酵時間的變化Fig.3 Variations of ethanol under different microelement

2.2.3 Zn2+及 Fe3+對發酵過程中 pH 值的影響 從圖 4可知,大量乳酸的產生使體系中氫離子濃度增高,進而使得pH值逐漸降低,添加Fe3+的發酵體系pH值降得最低,約為3.39,這也能間接地反映其乳酸產量較其他2種條件下較高.當發酵進行 60h后,pH值基本不發生變化,與此結果相對應,圖2中LDH及加Zn2t體系的ADH也呈下降趨勢,說明過低的pH值抑制酶活性.

圖4 三種發酵體系中pH值隨發酵時間的變化Fig.4 Variations of pH under different microelement

2.3 Zn2+及 Fe3+對餐廚垃圾發酵過程中淀粉利用率的影響

從圖5可知,添加Fe3+的條件下,淀粉的利用率最高,發酵 84h后,淀粉含量由 46.12%降至17.34%,較添加Zn2+及未添加微量元素時利用率分別提高了 38.5%,28.1%.說明 Fe3+的加入的確能提高淀粉的利用率.

圖5 三種發酵體系中淀粉利用率隨發酵時間的變化Fig.5 Variations of starch under different microelement

2.4 嗜淀粉乳桿菌開放式發酵過程中糖組分的變化

添加 0.204mg/L Fe3+并接種嗜淀粉乳桿菌2g/L于餐廚垃圾中,在發酵37℃進行開放式發酵,其發酵過程中各種糖組分濃度的變化如圖 6 所示.其中,葡萄糖,果糖,麥芽糖濃度先升高后降低,這可能是由于體系中存在的多糖降解成低糖,低糖最后被乳酸菌利用生成乳酸.發酵后期幾種糖濃度略有升高,這是乳酸積累到一定程度后其濃度對發酵進行反饋抑制的結果[17],而在整個過程中乳糖的產量很少,且較難被乳酸菌利用.

圖6 加Fe3+體系各種糖濃度隨發酵時間的變化Fig.6 Variations of sugar concentrations added with Fe3+

圖7 蔗糖、麥芽糖及乳糖的濃度隨發酵時間的變化Fig.7 Variations of sucrose, maltose and lactose

一般葡萄糖,果糖等單糖能直接被乳酸菌利用生產乳酸[2],為弄清楚二糖(蔗糖、麥芽糖及乳糖)的糖代謝途徑,將蔗糖,麥芽糖及乳糖作為單一基質分別代替 MRS培養基中的葡萄糖,滅菌后在37℃下厭氧發酵48h,分析這三種糖被轉化利用的情況(圖7).圖7與圖6的結果類似,蔗糖,麥芽糖以及乳糖在發酵過程中會轉變成葡萄糖,果糖,最終被嗜淀粉乳桿菌利用,且麥芽糖和乳糖被降解的速度極大于乳糖.

3 結論

3.1 接種嗜淀粉乳桿菌的餐廚垃圾開放式發酵體系所產乳酸量高于非開放式發酵體系.這可能是由于大量土著菌的存在,促進了餐廚垃圾中的高分子有機物水解成乳酸菌容易利用的低分子糖類物質.

3.2 Fe3+的加入能提高乳酸脫氫酶活性,抑制乙醇脫氫酶活性,使淀粉利用率和乳酸產量均高于對照體系,且能更好抑制其他有機酸的產生;而加Zn2+體系的乙醇脫氫酶(ADH)活性較高,導致副產物乙醇產量的增加,從而使淀粉利用率與乳酸產量低于對照體系.

3.3 在嗜淀粉乳酸菌的發酵體系中,二糖中的蔗糖和麥芽糖很容易降解成單糖(葡萄糖和果糖),從而被乳酸菌利用;而乳糖降解成單糖的速度緩慢.

[1] YUN Jong-jun,WEE Young-jung,RYU Hwa-won. Prodution of optically pure L(+)-lactic acid from various carbohydrates by batch fermentation of Enterococcus faecelis [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2003,33:416-423.

[2] 趙國振,熊向峰,陳朝銀.解淀粉乳酸細菌在 L-乳酸發酵生產中的應用 [J]. 中國生物工程雜志, 2009,29(7):134-139.

[3] Altaf M, Venkateshwar M, Srijana M, et al. An economicapp roach for L(+) 2lactic acid fermentation by Lactobacillus amylophilus GV6 using inexpensive carbon and nitrogen sources [J]. Appl. Microbiol., 2007,103:372-380.

[4] Thomsen M H, Guyot J P, Kiel P. Batch fermentations on synthetic mixed sugar and starch medium with amylolytic lactic acid bacteria [J]. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007,74:540-546.

[5] Muyanja C, Narvhus J A, Treimo J, et al. Isolation, characterization and identification of lactic acid bacteria from bushera: a Ugandan traditional fermented beverage [J]. Food Mierobio., 2002,80(2):201-210.

[6] Basa Janakiram Naveena, Mohammad Altaf,Kalva Bhadrayya, et al. Production of L(+) lactic acid by Lactobacillus amylophilus GV6 in semi-solid state fermentation using wheat bran [J]. Food Technol. Biotechnol., 2004,42(3):147-152.

[7] Naveena B J, Altaf M d, Bhadrayya K, et al. Direct fermentation of starch to L(+)-lactic acid in SSF by Lactobacillus amylophilus GV6 using wheat bran as support and substrate: medium optimization using RSM [J]. Process Biochemistry, 2005,40:681-690.

[8] 王旭明,汪群慧,馬鴻志,等.用乳酸細菌從有機廢棄物生產乳酸[J]. 現代化工, 2003,23(11):50-53.

[9] 潘麗軍,余 贇,鄭 志,等.米根霉乳酸脫氫酶的特性研究 [J].食品科學, 2003,24(11):23-26.

[10] 封文濤,李十中,張晗星,等.微量元素在線調控 L-乳酸發酵的研究 [J]. 現代化工, 2009,29(2):144-146.

[11] LI Hua, HU Xian-ming, XIE Ying-feng. Using high performance liquid chromatographic method for determination of organic acids [J]. Chinese Journal of Chromatography, 1998,16(5):424-426.

[12] 王吉順,關家稅,王淑仁,等.高效液相色譜法測定葡萄酒中含糖量 [J]. 色譜, 1992,10(6):369-371.

[13] 鄭 志,姜紹通,羅水忠,等.限氧與通氧條件下米根霉ADH突變株的碳代謝特性 [J]. 中國農業科學, 2006,39(6):1228-1232.

[14] 王旭明,汪群慧.高產乳酸細菌發酵廚余垃圾生產乳酸的試驗研究 [J]. 現代化工, 2005,25(Z1):148-150.

[15] Marcel H N Hoefnagel, Marjo J C Starrenburg, Dirk E Martens, et al. Metabolic engineering of lactic acid bacteria, the combined approach: kinetic modeling, metabolic control and experimental analysis [J]. Microbiology, 2002,148:1003-1013.

[16] Christopher D Skory. Isolation and expression of lactatedehydrogenase genes from Rhizopus oryzae [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(6):2343-2348.

[17] 熊宗貴.發酵工藝原理 [M]. 北京:中國醫藥科技出版社, 2001: 69-70.