鎘脅迫對菜豆幼苗基因組DNA多態性的影響

呂金印,邸麗俊,葉慶富 (1.西北農林科技大學生命科學學院,陜西 楊凌 712100；2.陜西理工學院科技處,陜西 漢中 72000；.浙江大學原子核農業科學研究所,浙江 杭州 10029)

鎘是生物毒性顯著的重金屬元素之一[1],在植物體內積累到一定程度時就會引起植株根系發育不良[2]、光合速率下降[3],細胞內的活性氧代謝失衡,葉片中丙二醛含量隨鎘濃度升高而逐漸升高[4],從而影響蛋白質的合成、運輸及降解代謝過程[5].還原型谷胱甘肽和脯氨酸含量是典型的逆境生理指標,在受到鎘污染時植物體內還原型谷胱甘肽和脯氨酸含量增加,以應對重金屬的毒害效應.基因組DNA作為遺傳信息的載體,最大的特點之一就是穩定性,然而鎘污染會對細胞DNA造成損傷,由此影響遺傳信息的傳遞.鎘進入細胞后能引起部分細胞周期的永久阻滯、凋亡,與 DNA損傷修復有關[6-8],并直接或間接造成遺傳毒性[9],影響基因表達調控與細胞信號轉導途徑[10].

隨機擴增多態性 DNA(RAPD)分析技術早期被用于檢測害蟲[11]、病毒、大腸桿菌[12-13]及大型藻類[14]中低劑量化學污染物造成的 DNA構象改變所引起的遺傳不穩定性.目前,該技術已廣泛用于東南景天屬植物的品種分類[15]、遺傳作圖[16]、土壤酶活性、微生物群落結構[17],以及水生生態系統中鎘污染對斑馬魚等生物體內 DNA損傷的檢測[18].有關重金屬污染對植物[19]、尤其是蔬菜作物[20]基因組DNA多態性的影響研究鮮見報道.本研究以菜豆幼苗為試材,結合多種生理指標,測定不同濃度鎘脅迫下地豆幼苗葉片DNA多態性的變化,構建RAPD評價體系,探討鎘脅迫對植物生長發育的影響,旨在為農業生產中鎘污染的預警與評價、蔬菜無害化栽培提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料培養

供試菜豆品種為地豆王2號(購自西安市華星種子公司).挑選籽粒飽滿種子,用 1%H2O2溶液滅菌 10min,經無菌水反復沖洗后,置于培養皿,恒溫培養箱催芽,溫度為:25℃;相對濕度: 70%～75%,待胚根長至 3cm長,移至長×寬×高: 20cm×10cm×8cm水培槽中,加Hoagland營養液,在光合培養室進行水培.溫度:晝/夜(27±3)/ (21±3)℃;濕度:(65±5)%;光照:晝/夜 14/10h,光強:150μmol/(m2·s).待子葉伸展完全,挑選生長一致的幼苗移入鎘處理水培槽中.植株長至三葉一心時,在同一生長期采用 CdCl2·2.5H2O處理,鎘處理濃度為0,20,40,80mg/L,每盆5株.每個處理10盆重復.處理7d后采樣,采集的菜豆幼苗樣品用蒸餾水沖洗,吸水紙吸干表面水分.一部分鮮樣用于測定生理指標;一部分樣品放入烘箱烘干,用于測定生物量及鎘含量;另一部分用液氮冷凍處理后冷凍(-20℃)保存,用于分析 DNA損傷狀況.

1.2 生物量測定

分別采各處理菜豆植株5株,用自來水反復沖洗,吸水紙吸干表面水分,105℃下殺青 15min, 80℃烘干至恒重,稱根、莖、葉各器官干重.

1.3 鎘含量測定

將 Cd2+處理菜豆幼苗植株分為根、莖、葉三部分,分別用自來水及去離子水沖洗,吸干水分,105℃殺青 15min,80℃烘干至恒重,磨碎混勻,加入HNO3-HClO4(4:1,V/V)混合酸,220℃沙浴消化,利用火焰原子吸收分光光度計(Z-5000賽曼,日立公司)測定Cd含量[21].

1.4 生理指標測定

丙二醛(MDA)含量測定采用TBA比色法[22];可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍 G-250法[23];脯氨酸(Pro)含量測定采用酸性茚三酮顯色法[22];還原型谷胱甘肽(GSH)含量測定采用DTNB顯色法[23].

1.5 菜豆幼苗葉片基因組 DNA 的提取與RAPD圖譜檢測

DNA的提取:稱0.2g菜豆葉片,加液氮充分磨碎,采用CTAB方法提取基因組總DNA.然后,加RNAase對DNA粗提液37℃下消化60min,以去除其中 RNA污染.棄消化后的上清液,沉淀用75%乙醇清洗2次,溶于滅菌雙純水中,進行下一步實驗.所得的 DNA以紫外分光光度法分別檢測A260和A280,計算A260/A280,如比值介于1.8～2.0之間則認為DNA純度良好.

RAP-PCR擴增及檢測:8條隨機引物、TaqDNA聚合酶及dNTPs均購于大連寶生物工程技術有限公司.引物編號及堿基序列如下[24-27], P1:d5’(GTGACGTAGG)3’; P2:d5’(CCGAATTCCC)3’;P3:d5’(GGCTGCAGAA)3’;P4:d5’(GGTGCGGGAA)3’; P5: d5’(GCGGTTTTGC)3’; P6:d5’(GGCACTGAGG)3’; P7: d5’(CACTCTCCTC)3’; P8:d5’(CACTCTCCTC)3’.

PCR擴增反應體系的總體積為25μL,其中包括cDNA模板2μL,10×Buffer 2μL,MgCl2(25mmol/L) 2μL, dNTPs (2mmol/L) 2μL,引物(10μmol/L) 2μL, TaqDNA 聚合酶(5U/μL)0.25μL,加 ddH2O 到25μL;擴增反應程序為 94℃預變性 5min后, 94℃變性30s,40℃退火30s,72℃延伸90s,40循環;72℃延伸 7min.采用 1%瓊脂糖凝膠(加入EB使其終濃度為 0.5μg/mL)電泳檢測 PCR擴增產物.

1.6 數據處理

耐性指數(TI)=鎘處理菜豆生物量/對照生物量×100%[28].

根系鎘滯留率(RR)=(地下部分鎘含量-地上部分鎘含量)/地下部分鎘含量×100%[22].

基因組模板穩定性(GTS)用下式計算:GTS= (1-a/n)×100%,式中,a為處理組菜豆幼苗葉片的RAPD多態性譜帶數,即與對照組相比,處理組新出現的和消失的PCR譜帶之和,n為對照組的總譜帶數[14].

試驗數據用 SPSS16.0軟件進行方差分析(ANOVA)和LSD檢驗,數值結果表示用3次重復的平均值±標準差.

2 結果與分析

2.1 不同濃度鎘處理對菜豆幼苗生物量的影響

生物量是衡量植株生長對重金屬耐性的重要指標.本試驗中隨著 Cd處理濃度的增加,菜豆幼苗根、莖、葉生物量均呈下降趨勢,中、高濃度Cd處理(40,80mg/L)下葉、根生物量與對照相比差異顯著(P＜0.05)(圖1A),尤其高濃度Cd處理下根生物量下降了 15.3%.而低濃度鎘(20mg/L)處理下菜豆植株生物量與對照差異不大.耐性指數是指植株對鎘的忍耐程度.本試驗中隨著 Cd處理濃度的升高,耐性指數呈下降趨勢,與生物量變化一致(圖1B).

2.2 不同濃度鎘處理對菜豆幼苗鎘含量的影響

本試驗中隨著Cd處理濃度增加,菜豆幼苗植株不同器官中鎘含量上升(圖 2A),尤其在根中增幅較大.與對照相比,20,40,80mg/LCd處理下根中分別增加了9.6、40.8和64.5倍.菜豆不同器官對鎘的吸收累積能力為:根＞葉＞莖.不同濃度鎘處理根系對鎘的滯留率明顯高于對照(圖 2B).可能是降低鎘向地上部位的遷移力,以減輕過量鎘對其他器官的毒害作用,提高植物的忍耐能力.

圖1 不同濃度Cd2+處理對菜豆幼苗生物量及其耐性指數的影響Fig.1 Effect of different Cd2+ concentration on the biomass and tolerance index in Phaseolus vulgaris seedling

2.3 不同濃度鎘處理對菜豆幼苗生理特性的影響

丙二醛(MDA)通常作為植物對逆境反應及細胞膜脂過氧化程度的重要指標.本試驗中,隨著Cd處理濃度的增加,菜豆葉片MDA含量升高(圖3A),3種Cd濃度(20,40,80mg/L)處理下分別比對照增加了0.3,1.8和0.99倍.

可溶性蛋白和脯氨酸(Pro)是植物體內主要的滲透調節物質.一般認為,重金屬脅迫影響植物體內蛋白質代謝.本試驗中,低濃度 Cd (20mg/L)處理下可溶性蛋白含量升高,中、高濃度 Cd(40,80mg/L)處理下蛋白含量下降(圖3B).可能是在低濃度鎘脅迫下誘導產生一些逆境蛋白,高濃度鎘處理下植株體內蛋白質合成受阻,分解加快.

圖2 不同濃度Cd2+ 處理對菜豆幼苗鎘含量及滯留率的影響Fig.2 Effect of different Cd2+ concentration on the content of Cd and the retention rate in Phaseolus vulgaris seedling

非酶物質還原型谷胱甘肽(GSH)是植物細胞中重要的抗氧化劑之一.GSH可以通過調節膜蛋白巰基與二硫鍵化合物的比例,對細胞膜起保護作用.本試驗中,低、中濃度 Cd(20, 40mg/L)處理下 GSH、Pro含量升高,高濃度Cd(80mg/L)處理下則下降,且降幅顯著(P＜0.05)(圖3C、3D).

2.4 不同濃度鎘處理下菜豆幼苗 DNA純度電泳檢測

泳道a、b、c、d分別代表0,20,40,80mg/L鎘處理;M:代表分子大小標準參照物.

圖3 不同濃度Cd2+ 處理對菜豆幼苗生理特性的影響Fig.3 Effect of different Cd2+ concentration on physiological characteristics in Phaseolus vulgaris seedling

DNA作為生物體主要遺傳物質,具有相對穩定性.對不同鎘脅迫處理的菜豆葉片同條件同批次提取DNA,進行電泳檢測(圖4),對照組條帶亮度清晰銳利,沒有拖尾,表明提取的DNA完整性良好,沒有降解.20,40mg/L鎘處理下,DNA樣品也保持了較好的完整性.但在 80mg/L鎘濃度處理下,DNA條帶出現大幅彌散和拖尾,表明高濃度鎘脅迫影響菜豆植株體內的遺傳物質合成和儲存,引起 DNA大量降解.

圖4 不同濃度Cd2+處理下菜豆幼苗DNA電泳檢測Fig.4 Electrophoretogram of genomic DNA extracted by CTAB in leaves of Phaseolus vulgaris seedling under different Cd2+ concentration

2.5 基因組DNA多態性(RAPD)分析

為進一步分析鎘脅迫對DNA層面的損傷,本試驗對同批次提取的DNA進行遺傳標記多態性分析,選用8條隨機引物P1～P8,以葉片提取的DNA為模板進行PCR反應,圖5和表1顯示8條隨機引物都獲得了良好穩定的多態性譜帶.鎘處理下DNA多態性譜帶與正常植株相比存在明顯差異.與正常植株相比,20,40mg/L Cd處理后多態性譜帶已經發生明顯偏移(如圖5所示,“＋”代表新出現的條帶,“－”代表消失的條帶,“I”代表帶強增強的條帶,“D”代表帶強減弱的條帶),引物 P1、P2、P3、P4、P6、P7、P8的多態性譜帶中的部分條帶出現缺失,引物P1、P4、P6、P7的多態性譜帶中還出現了新的條帶,此外P3、P4、P5、P6、P7、P8的某些條帶還出現增加或強弱的現象,說明中低濃度的Cd處理就已經對基因組DNA造成了一定的損傷.當Cd濃度提高至80mg/L后,8條引物中幾乎所有的譜帶都消失了,說明此時的DNA模板已經受到了非常嚴重的損傷.以表1數據為基準,根據公式計算基因組模板的穩定性(圖6).20,40mg/L Cd處理后,基因組已經出現不穩定,穩定性僅為69.6%和60.9%,80mg/L處理后基因組出現大面積崩潰,穩定性降為2.1%.

圖5 不同濃度鎘處理下菜豆幼苗葉片RAPD圖譜Fig.5 RAPD profiles of DNA from leaves of Phaseolus vulgaris seedling under different Cd2+ concentration

圖6 菜豆幼苗葉片基因組模板穩定性(%)Fig.6 The Stability of genome template of Phaseolus vulgaris seedling (%)

表1 鎘處理下菜豆幼苗葉片基因組多態性變化Table 1 Changes of total bands in control, polymorphic bands and varied bands in Cd-contaminated in leaves of phaseolus vulgaris seedlings

3 討論

鎘是植物非必需元素,其毒害效應已受到人們的廣泛關注[6].鎘污染會對農作物生理生化上造成不同程度的影響.

一般認為,植物在逆境下受傷害越嚴重, MDA含量越高[29].本試驗中,MDA含量隨著鎘處理濃度的上升而增加,說明鎘脅迫已對膜系統造成損傷.還原型谷胱甘肽(GSH)對鎘脅迫的解毒起關鍵作用.高等植物產生的植物螯合肽(PC)是鎘解毒的廣泛機制[30],而還原型谷胱甘肽(GSH)是 PC的合成前體,同時也可以與金屬離子直接絡合,其水平決定植物自身解毒能力的強弱.本試驗中,在低、中濃度鎘處理(20,40mg/L)下菜豆幼苗體內GSH含量升高,高濃度Cd2+(80mg/L)處理下 GSH含量下降,且降幅顯著.Liu等[19]認為,隨鎘含量升高,大麥幼苗根系生長及可溶性蛋白總量均受到抑制.本試驗表明,低濃度鎘處理下,可溶性蛋白及Pro含量略增,中、高濃度則下降.可溶性蛋白和 Pro的變化趨勢與我們在芹菜中的研究結果一致[22].

基因組 DNA是遺傳信息的載體,具有遺傳穩定性,但是鎘污染會造成DNA損傷,從而干擾遺傳信息的順利傳遞.鎘等重金屬進入生物體內,干擾生殖過程中的細胞周期[7],如DNA復制、有絲分裂、原生質體的子細胞分裂和形成等,且與鎘離子呈劑量-依賴關系[9].在早期的研究中,Williams等分別采用象鼻蟲[11]、擬南芥[31]、大嘴鱸魚[32]建立RAPD模型,用以分析DNA損傷,即RAPD圖譜表現為譜帶強度增或減,譜帶的消失或新增.本試驗與 Liu等[19]對鎘處理大麥幼苗 DNA損傷結果相類似.在低、中濃度鎘處理下,DNA樣品保持了較好的完整性.但在高濃度鎘(80mg/L)處理下,DNA條帶出現彌散和拖尾,可能是由于高濃度鎘造成基因組DNA的大面積斷裂和崩潰,形成許多彌散小片段DNA.

RAPD圖譜的變化趨勢可以定性的衡量基因組模板DNA的穩定性[33].本研究表明,低濃度鎘(20mg/L)脅迫已對菜豆基因組DNA造成損傷,多態性譜帶中出現了條帶增加和缺失現象,基因組穩定性降至69.6%;當鎘濃度提高至80mg/L時,基因組 DNA造成了大面積損傷,多態性譜帶幾乎全部消失,基因組穩定性降至2.1%.

綜合生理和生化指標,本研究中低濃度鎘(20mg/L)脅迫就會造成菜豆幼苗的損傷,但因植物體內本身也存在對重金屬毒性的抵抗和修復作用機制,此時植株可以維持正常的生理代謝過程,外在生理生長特性暫時沒有明顯的可見變化,但通過RAPD技術在基因組層面上則可以觀察到明顯的損傷,這種對遺傳物質的直接損傷將影響正常的遺傳代謝.高濃度的鎘(80mg/L)脅迫則會導致植物體內生理代謝系統的紊亂和遺傳系統的崩潰,從而導致植株死亡.有關鎘對菜豆幼苗DNA的損傷機制還有待進一步研究.

4 結論

4.1 隨著鎘處理濃度的增加,菜豆幼苗生物量、還原型谷胱甘肽、脯氨酸及可溶性蛋白含量下降植株各器官中的鎘含量增加.

4.2 8條引物均產生了獨特的多態性條帶.對照組葉片基因組DNA的RAPD圖譜獲得46條譜帶.

4.3 與對照相比,鎘濃度處理下的 RAPD圖譜發生了改變,呈現譜帶強度增強或減弱、譜帶消失或新增.20,40mg/L鎘處理下出現新條帶分別為2和4條.隨鎘處理濃度增加,消失的條帶增多,尤其80mg/L處理下消失條帶達44條,可能與鎘處理引起的DNA構象改變及多種損傷有關.

4.4 RAPD分析技術可作為蔬菜等相關作物早期重金屬污染傷害的有效評價指標,可為輕度鎘污染區菜豆等蔬菜品種選育、鎘污染毒性評價提供依據.

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