154例RhD陰性表型個體的D基因多態性分析

熊 莉，孫 瑜，李國良，唐 綺，肖 莉，吳 紅，翁美芝

(江西省血液中心，江西 南昌 330077)

154例RhD陰性表型個體的D基因多態性分析

熊 莉，孫 瑜，李國良，唐 綺，肖 莉，吳 紅，翁美芝

(江西省血液中心，江西 南昌 330077)

目的研究RhD陰性個體基因多態性。方法采用抗人球蛋白試驗(IAT)確認RhD陰性個體；對RhD陰性個體再運用PCR-SSP方法分析其基因分布情況。結果154例IAT確定為RhD陰性的個體中，86例所檢測的外顯子完全缺全(55.84%)、36 例完整(23.38%)、32 例部分缺失(20.78%)；其檢出 DelRhD1227A、弱 D15 型、RHD-CE(2～9)-D、DVa(Has)、DVIⅢ等多種RhD陰性等位基因。結論江西地區血清學RhD陰性人群中存在RHD基因且呈現多態性，提示可聯合應用血清學和基因分型兩種方法來檢測D抗原。

RhD；基因；多態性；血型

Rh血型是人類最復雜和最具多態性的紅細胞血型系統，該血型至少由57種不同的抗原組成。D抗原是免疫原性最強的Rh血型抗原，在臨床輸血、新生兒溶血等方面有重大意義。因此，鑒定RhD抗原表型被列為臨床輸血常規檢查[1]。近年來，國內外研究發現不同種族在抗人球蛋白試驗確認為RhD陰性的個體中仍存在RHD基因[2，3]，提示RhD陰性個體存在遺傳多態性并具有廣泛的種族背景差異。我們對江西地區154例RhD陰性樣本進行血清學檢測并應用PCR-SSP技術分析RHD基因型，以探討江西個體RhD陰性的分子基礎，以期發現其多態性規律。

1 材料與方法

1.1 研究對象 154份RhD陰性無親緣關系的血液樣本均取自江西省血液中心的健康無償獻血者。

1.2 血清學RhD陰性確認 對初篩為RhD陰性的標本采用抗人球蛋白試驗，至少用3種以上抗D血清進行Rh陰性確認。(北京金豪,Lot:201109096，上海血液生物，Lot:20111212,Milliore,Lot：BMB1101J)

1.3 基因組DNA提取 取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，用Texas基因組DNA抽提試劑盒分離獲得，-20℃保存待用。

1.4 Rh血型基因分型 采用天津市秀鵬生物技術開發有限公司的紅細胞RHD陰性鑒定基因檢測試 劑 盒 (檢 測 RHD 基 因 1、5、6、7 外 顯 子 ，Lot：1109，有效期：20120915)，對 154 例血清學確認為RhD陰性的標本進行檢測。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀觀察結果。

2 結果

154 例間接抗人球蛋白試驗(IAT)確定為RhD陰性的個體中，86例所檢測的外顯子完全缺全(55.84%)、36 例 完 整 (23.38%)、32 例 部 分 缺 失(20.78%)； 其檢出弱 D15型 1例 (0.65%)，Del-RhD1227A 型 26 例 (16.88%)，RhD+9 例 (5.84%)，RHD-CE(2～9)-D16 例 (10.39%)，DVa(Has)1 例(0.65%)，DVIⅢ1 例(0.65%)。 見表 1。

表1 表型RhD陰性個體RHD外顯子及等位基因分析

3 討論

Rh血型基因位于染色體 1p34.3～36.1，由RHCE和RHD兩個高度同源結構基因組成，各含有10個外顯子，二者核苷酸序列同源性高達96%。兩基因差異最大的區域位于外顯子4，5，7，10及內含子4，與RHCE基因相比，RHD基因內含子4中有1個649bp序列的缺失。

目前發現歐洲白種人以高加索人為代表，絕大多數完全缺失RHD基因，屬最常見型，這也代表了絕大部分RhD陰性的機制；非洲黑人則以RHDψ基因、RHD-CE-D雜交基因這兩種情況為主；在東亞黃種人中，特別是日本人、韓國人、中國臺灣、香港和大陸人主要有3種情況：RHD基因完全缺失、RHD基因部分缺失、RHD基因完整無缺失。其中RhD陰性基因多態性表現為RHD-CE(2～9)-D2、DEL(1227A)、RHD710delC、RHD(M295I)、RHD(X418L)等多種等位基因形式。

本研究顯示，154份經抗人球蛋白試驗確認為RhD陰性的樣本中55.84%完全缺失D基因，23.38%D基因外顯子完整,20.78%D基因部分缺失，與廣東、福建報道的相關數據相似[4，5]。 其中RHD基因完整無缺失中以DEL(1227A)等位基因為主，占RhD陰性樣本的16.88%。DEL(1227A)是RHD基因第9外顯子最后1個堿基發生突變即1227G>A，導致正常的RHD基因讀碼框發生改變從而影響了mRNA的拼接導致Rh抗原的表達異常。我國人群中，97.1%的DEL型為l227G>A突變，這為PCR-SSP檢測其突變位點提供了良好的平臺，因此基因分型方法已成為未來檢測DEL型的趨勢[6]。另外，還發現有弱D15型、DVa(Has)、RHD-CE(2～9)-D、DVIⅢ等多種RhD陰性等位基因表現形式，與深圳地區RhD陰性基因型分布情況接近[7]。基因結構呈明顯的多態性，這一結果與以往中國廣東[8]、臺灣[9]和海南[10]報道一致，表明不同地區中國人具有相同的Rh血型遺傳背景。另外，還有14例標本未能確定RhD陰性的分子基礎，可能與實驗操作或試劑盒的局限性有關，將在以后的工作中確認完善。

近幾年,研究者發現一些RhD陰性個體中能檢出RhD基因,這些個體擁有D基因,卻不表達D抗原,推測有兩個方面的原因：一是RHD基因存在核苷酸片段的插入、缺失或者替換導致無義突變[8,11]，二是這些個體并非真實的RhD陰性，而是因D抗原較弱，吸收放散試驗也未能檢出，比如本研究中9例外顯子表現為RhD陽性的陰性個體。

本研究說明在中國人中,RhD陰性個體RHD基因存在著多態性,針對白種人RhD陰性機制只測定幾個外顯子的RHD基因定型試劑盒并不適合中國人。因此當PCR-SSP出現無法解釋的結果或需要確認具體的弱D型或部分D型別時，必須進一步通過RHD基因序列分析。在臨床應用中，特別是在預測新生兒溶血病中要特別注意基因定型的假陽性和假陰性問題。鑒于輸血醫學關系到受血者的寶貴生命，不容絲毫差錯，因此我們認為在中國RHD基因分型方法尚未成熟，在完全替代RhD表型血清學檢測之前仍需對中國人RHD基因結構進行深入研究，以建立適合本地區人群RHD基因分型策略。

[1]杰夫·丹尼爾主編.朱自嚴主譯.人類血型[M].北京:科學出版社,2007:259-260.

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[11]Avent ND,Martin PG,Armstrong-Fisher SS,et al.Evidence of genetic diversity underlying RhD,weak D and partial D phenotypes as determined by multiplex polymerase chain reaction analysis of the RHD gene[J].Blood,1997,89(7):2568-2577.

R457.1+1,Q346+.5

A

1674-1129(2012)04-0340-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.006

江西省衛生廳科技資助(20082010)

熊莉，女，1982年出生，碩士，主治醫師，主要從事輸血醫學研究。