抗真菌藥敏試驗(yàn)在2種不同瓊脂平板的比較

劉龍燕，袁水斌，鄒學(xué)森，王春陽(yáng),王占科

(1、江西省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西 南昌 330029；2、解放軍第九四醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330000)

抗真菌藥敏試驗(yàn)在2種不同瓊脂平板的比較

劉龍燕1，袁水斌1，鄒學(xué)森1，王春陽(yáng)1,王占科2

(1、江西省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西 南昌 330029；2、解放軍第九四醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330000)

念珠菌；培養(yǎng)基；藥敏試驗(yàn)

隨著真菌感染發(fā)病率的不斷上升，真菌感染性疾病的治療也面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，且有關(guān)耐藥菌株的報(bào)道也逐漸增多。腫瘤病人因自身免疫功能低下,受各種醫(yī)源性因素影響較多,更易發(fā)生院內(nèi)感染[1],特別是深部真菌感染。真菌體外藥敏試驗(yàn)也越來(lái)越顯得重要，這也是臨床上用以評(píng)價(jià)藥物敏感性最基本的方法之一。

目前認(rèn)為準(zhǔn)確性、重復(fù)性最好的抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方法是美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)推出的酵母菌的液體培養(yǎng)基稀釋法抗真菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法(M-27)[2]，但該方法操作復(fù)雜，難以作為臨床常規(guī)檢查項(xiàng)目。CLSI發(fā)表的“酵母菌紙片擴(kuò)散法抗真菌藥敏試驗(yàn)方案”(M44-A)，操作方法簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀[3]，而且有商品化的抗真菌藥敏紙片供應(yīng)，有利于作為臨床常規(guī)項(xiàng)目檢測(cè)。由于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)酵母樣真菌體外藥敏紙片擴(kuò)散法選用培養(yǎng)基配方不是完全一致。因此，對(duì)其測(cè)試結(jié)果可信度受到一定的影響。我們選用5種溫州康泰生物科技有限公司的BIO-KONT抗真菌藥敏紙片，在真菌藥敏專用瓊脂(溫州康泰生物有限公司)和葡萄糖亞甲藍(lán)改良瓊脂(M-H瓊脂)2種培養(yǎng)基上，對(duì)臨床分離的193株常見(jiàn)酵母菌做了檢測(cè)，以康泰公司的產(chǎn)品為參照，得到了較為滿意的比較結(jié)果。現(xiàn)將比較分析果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 2010年3月至2010年5月期間從臨床送檢的確診真菌感染的標(biāo)本193株，包括痰、咽拭子、分泌物及尿液等。193株常見(jiàn)臨床各種標(biāo)本分離的致病酵母菌，并經(jīng)念珠菌顯色培養(yǎng)基(科瑪嘉)和酵母樣真菌糖同化試驗(yàn)生化管鑒定至種；其中白念珠菌162株,熱帶念珠菌20株，葡萄牙念珠菌1株，近平滑念珠菌7株，季也蒙念珠菌2株，曲霉菌1株。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株 白色念珠菌ATCC10231由江西省臨檢中心提供。

1.3 培養(yǎng)基 (1)真菌藥敏專用瓊脂：溫州康泰生物科技有限公司產(chǎn)品，專門用于酵母菌的藥敏紙片法試驗(yàn)，主要成分含PRMI1640瓊脂粉，葡萄糖，緩沖液，抑菌劑。培養(yǎng)基使用了標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿 (直徑9cm)，瓊脂厚 0.5cm，pH7.0。(2)M-H 改良瓊脂：美國(guó)輝瑞公司推薦用于氟康唑真菌藥敏試驗(yàn)紙片法的藥敏培養(yǎng)基。含10.8gM-H瓊脂粉，6g葡萄糖，亞甲藍(lán)(1mg/ml)200μl，1g科瑪嘉。 經(jīng) 121℃，15min 高壓滅菌后，水浴55℃后使用了標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿 (直徑9cm)，倒瓊脂厚0.5cm備用。

1.4 抗菌藥物紙片 溫州康泰生物科技有限公司的BIO-KONT抗真菌藥敏紙片：兩性霉素B、氟康唑、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑和咪康唑。

1.5 紙片擴(kuò)散法 使用的2種瓊脂培養(yǎng)基均采用相同的方法步驟。在藥敏試驗(yàn)前，菌株需作純化分離，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性；將每個(gè)菌株都轉(zhuǎn)到法國(guó)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上，35℃生長(zhǎng)24h。按照BIO-KONT產(chǎn)品說(shuō)明書配制菌液：用直接菌落懸液法制備濃度為(5×105)CFU／ml的菌懸液(先配0.5麥?zhǔn)蠞岫龋儆蒙睇}水1:1稀釋)；對(duì)于克柔念珠菌則要先配0.5麥?zhǔn)蠞岫龋儆蒙睇}水1:10稀釋；對(duì)于新生隱球菌，配1.0麥?zhǔn)蠞岫龋瑹o(wú)需稀釋。在接種前，平板先置35℃干燥20～25min。吸0.5ml菌懸液，傾注于平板表面，用接種棉棒涂布均勻，多余的液體用棉簽或移液管移走。然后，平放平皿，在35℃干燥10min,貼紙片。最終要求，在瓊脂表面，菌落恰好呈融合生長(zhǎng)。培養(yǎng)24h后立即測(cè)量抑菌圈，測(cè)量時(shí)間＜24h。因此，對(duì)于氟康唑和伊曲康唑，用相應(yīng)不同的培養(yǎng)時(shí)間，如果對(duì)于某些菌株在培養(yǎng)過(guò)夜后未見(jiàn)生長(zhǎng)，那么應(yīng)再培養(yǎng)24h，而對(duì)于隱球菌屬在30℃培養(yǎng)24～48h。

1.6 結(jié)果判讀 培養(yǎng)18～24h后用刻度尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑.如M-H瓊脂平板上有部分菌株生長(zhǎng)不良，可再培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。多烯類抗真菌藥物(兩性霉素B)測(cè)量清晰的抑菌環(huán)直徑，抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)的為耐藥突變株。按溫州康泰真菌藥敏試驗(yàn)操作說(shuō)明書判讀結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩種培養(yǎng)基檢測(cè)193株酵母菌對(duì)5種抗真菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 兩性霉素B：180株酵母菌對(duì)兩者均敏感，2株耐藥，11株中敏，符合率達(dá)到99.4%(χ2=0,P>0.05)； 氟康唑：169 株對(duì)兩者均敏感，8株均耐藥，16株中敏，符合率為89.5%(χ2=0.5，P>0.05);5-氟胞嘧啶：50株對(duì)兩者均敏感，12株均耐藥，2株中敏，兩者的符合率為33.14%(χ2=143,P<0.01)；伊曲康唑：162株對(duì)兩者均敏感，10株均耐藥，13 株中敏， 符合率為 95.89%(χ2=6.13，P>0.05);咪康唑：16株對(duì)兩者均敏感，30株耐藥，146株中敏，符合率為 99.47%(χ2=0，P>0.05)

2.2 193株念珠菌對(duì)5種抗真菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表1，其總敏感性兩性霉素B為93.3%，氟康唑敏感性為87.56%，5-氟胞嘧啶敏感性為25.9%，伊曲康唑敏感性為83.93%，咪康唑敏感性為8.3%。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株用真菌藥敏專用瓊脂平板試驗(yàn)結(jié)果每批所測(cè)得抑菌環(huán)直徑均在規(guī)定的范圍內(nèi)，且重復(fù)性較好，抑菌圈直徑之差<2mm。

表1 193株酵母菌對(duì)5種抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

紙片擴(kuò)散法抗真菌藥物敏感試驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果直觀和適合臨床常規(guī)標(biāo)本檢測(cè)的特點(diǎn)。溫州康泰抗真菌藥敏片被公認(rèn)為是較好的真菌藥敏試劑。它與其公司生產(chǎn)的真菌藥敏專用瓊脂組合可以得到穩(wěn)定、清晰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但真菌藥敏專用瓊脂價(jià)格較貴。我們實(shí)驗(yàn)室根據(jù)他人的經(jīng)驗(yàn)在以M-H瓊脂配制的培養(yǎng)基中加入1g科瑪嘉。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除了5-氟胞嘧啶在M-H改良瓊脂上的判讀結(jié)果與CLSI相差甚遠(yuǎn)，其他藥敏紙片的結(jié)果與CLSI的符合率都較高[5]。這與徐修禮等[6]的報(bào)道一致，與陳翠敏的報(bào)道有差異[7]。咪康唑藥敏試驗(yàn)的敏感性較低，但是其在兩種培養(yǎng)基上的耐藥株較多，因此其符合率較高，這與咪康唑長(zhǎng)期大量使用耐藥有關(guān)，現(xiàn)在臨床基本不再使用咪康唑。根據(jù)此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)室的藥敏試驗(yàn)不再使用咪康唑藥敏紙片。與真菌藥敏專用瓊脂相比較，除外5-氟胞嘧啶紙片，其他紙片的符合率都較高，但由于用真菌藥敏專用瓊脂的成本高于M-H改良瓊脂，M-H亞改良瓊脂用于溫州康泰公司的BIO-KONT抗真菌藥紙片法操作簡(jiǎn)便、觀察時(shí)間短、成本低廉，能及時(shí)的為臨床提供有利的參考資料，也是值得在臨床上推廣的一種藥敏試驗(yàn)篩選方法。所以，建議將M-H改良瓊脂用于除外5-氟胞嘧啶 BIO-KONT抗真菌藥紙片法，可以代替真菌藥敏專用瓊脂。在BIO-KONT紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果判讀方面存在著一些不足：(1)對(duì)于多烯類抗真菌藥如：兩性霉素B，抑菌圈較清晰，結(jié)果較好判讀；(2)對(duì)于咪唑類抗真菌藥，在正常生長(zhǎng)菌落形成的抑菌圈內(nèi)，可能會(huì)出現(xiàn)由較小的部分被抑制的菌落形成的抑菌圈，測(cè)量時(shí)以正常生長(zhǎng)的菌落(80%生長(zhǎng)處)形成的抑菌圈為準(zhǔn)，其內(nèi)部的較小菌落不應(yīng)視為突變株。在溫州康泰紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中也應(yīng)注意培養(yǎng)時(shí)間對(duì)藥敏結(jié)果的影響，培養(yǎng)18～24h后應(yīng)馬上測(cè)量抑菌圈，因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致假耐藥，特別是對(duì)于咪唑類藥物。即培養(yǎng)過(guò)夜后應(yīng)檢查平板，如果抑菌圈清晰，應(yīng)馬上測(cè)量。如果對(duì)于某些菌株在培養(yǎng)過(guò)夜后未見(jiàn)生長(zhǎng)，那么應(yīng)再培養(yǎng)24h。這些不足對(duì)本次試驗(yàn)結(jié)果也有著一定的影響。

腫瘤目前認(rèn)為是一種慢性疾病,腫瘤患者的一般狀態(tài)差,免疫功能低下,特別是細(xì)胞免疫功能低下,加之住院期間長(zhǎng)期使用抗生素，放、化療也損害了機(jī)體免疫屏障,更易發(fā)生真菌醫(yī)院感染,嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。醫(yī)院感染已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的突出課題。真菌感染的復(fù)雜性和不斷出現(xiàn)新的機(jī)會(huì)致病真菌,且感染難以控制,常成為終末感染而導(dǎo)致病人死亡,早期發(fā)現(xiàn)和診斷真菌感染,提高真菌檢測(cè)水平,是降低腫瘤病人死亡率的重要措施。如何快速、準(zhǔn)確的分離、鑒定，并給予耐藥性報(bào)告，這就迫切要求人們關(guān)注、重視。總之，我們要從源頭上控制并減少真菌感染的發(fā)生、發(fā)展，是需要多方面的通力協(xié)作，特別是當(dāng)今濫用抗菌藥物的情況，應(yīng)予以根除。與此同時(shí)，規(guī)范化技術(shù)操作以及優(yōu)良且先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用需提高。

[1]李若瑜，王端禮.密切結(jié)合臨床，提高真菌學(xué)檢驗(yàn)水平[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，203，26(9):521-523.

[2]NationaI committee for Clinical Latoratory Standards.Reference method for broth dilution antifugal susceptibility of yeasts[S].M-27A.CLSI,1997：l-13.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Zone diameter interpretive standards and corresponding minimal inhibitory concentration(MIC)interpretive breakpoints[S].N=M44-si.CLSI.2006.

[4]劉錦燕，項(xiàng)明潔.抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方法研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2009，24(12)：927-931.

[5]A Espinel-Ingroff，E Canton，D Gibbs，et a1.Correlation of Neo—Sensitabs tablet diffusion assay results on three different agar media with CLSI broth microdilution M27-A2 and disk diffusion M44-A results for testing susceptibilities of Candida spp.and Cryptococcus neoformas to amphoteriein B，caspofungin，fluconazole，itraconazole，and voriconazole[J].journal of clinicl Microbiologg,2007,45(3):858-864

[6]徐修禮,楊佩紅,孫怡群,等.真菌藥敏紙片擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用研究[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2006，24(4)：278-279.

[7]陳翠敏,府偉靈,張曉兵,等.抗真菌藥敏試驗(yàn)在3種不同瓊脂平板的比較[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2006，16(11)：1307-1309.

R446.5,Q939.92,R978.5

B

1674-1129(2012)04-0407-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.046