多維分離策略分離半枝蓮中野黃芩苷的實驗研究

王立恒，遲曉飛，彭金詠，齊 艷，許麗娜，尹連紅，韓 旭，許有威，趙艷艷

(1.大連市第二人民醫院 康復中心，遼寧 大連 116011; 2.大連醫科大學 藥學院, 遼寧 大連 116044)

中藥半枝蓮別名金挖耳、狹葉韓信草、并頭草等，為唇形科黃芩屬植物半枝蓮Scutellaria barata D. Don的干燥全草[1]。臨床多用于治療肝癌、胃癌、肺癌等疾病，主要有效成分是黃酮類化合物[2-4]。野黃芩苷是半枝蓮中一種含量較高的活性物質，其含量高低與對腫瘤細胞的抑制作用呈正相關[5]，對臍靜脈血管內皮細胞形成有促進作用[6]，另外能夠影響到神經系統[7], 因此具有較高的研究價值。然而傳統野黃芩苷的分離制備方法主要為反復柱層析，制備方法較繁瑣，操作時間太長，重復性較差。有必要開發一種適合野黃芩苷制備的高效分離制備方法。

本研究采用多維分離策略對半枝蓮中野黃芩苷進行分離。半枝蓮粗提物先后經過大孔樹脂法，有機溶劑萃取法，以及高速逆流色譜法(high speed counter-current chromatography, HSCCC)在較優的分離條件下進行分離，并采用高效液相色譜法分析，質譜儀鑒定所分離化合物的結構。這種多維分離策略兼具高效、便捷的優勢，將為高效穩定獲取半枝蓮中野黃芩苷奠定理論和實踐基礎。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

TBE-300A高速逆流色譜儀，TBP-50A恒壓恒流微量泵(同田生化技術，上海)、8823-B紫外檢測儀(新技術應用研究所，北京)、HX-1050恒溫循環器(博醫康實驗儀器，北京)、N2000色譜數據工作站(浙江大學智達信息工程，浙江)。

Agilent 1200 HPLC包括在線真空脫氣機、四元泵、自動進樣器、紫外檢測器、Chemstation 工作站(Agilent,USA)。

API 3200三重四級桿液相色譜-質譜聯用儀(Applied Biosystems, USA)配置有電噴霧離子源(ESI)。

半枝蓮藥材(千草源有限公司，云南)經鑒定為唇形科黃芩屬植物半枝蓮Scutellaria barata D. Don的干燥全草。野黃芩苷標準品購自中國藥品生物制品檢定所(編號為880-200001)。

甲醇、正丁醇、乙酸乙酯均為分析純試劑(科密歐，天津)；95%醫用乙醇(天源藥業，盤錦)；乙腈為色譜純試劑(TEDIA, USA)；雙蒸水由Milli-Q (Millipore, USA) 制備得到；D101大孔樹脂(天津農藥廠，天津)；C18色譜柱(5 μm, 4.6×250 mm, 華譜新創科技，北京)

1.2 高效液相色譜分析條件

儀器：Agilent 1200 HPLC；色譜柱：C18；流動相：乙腈(A)，水(B)；流速：1 mL/min；檢測波長：280 nm；進樣體積：15 μL；梯度條件：5%A-20 min-30%A-15 min-50%A。

1.3 質譜分析條件

負離子模式下，將樣品的甲醇溶液(1000 ng/mL)以恒定流速10 μL/min的速度泵入質譜儀中，氮氣壓力為50 psi，電噴霧電壓和溫度分別為5500 V和700℃。氮氣作為氣簾氣和碰撞氣的壓力分別設為12 psi和6 psi，去簇電壓和入口電壓分別設為50 V和5 V。碰撞能設為20 V，錐孔電壓為35 V。

1.4 半枝蓮的提取和分離過程

半枝蓮粗提物制備方法：半枝蓮生藥材1000 g用70%的乙醇水溶液(料液比為1∶8，w/v)回流提取2次，3 h/次。兩次提取液經過濾后合并，60℃減壓回收溶劑真空干燥后得到棕黃色粉末，密封儲存。

大孔樹脂分離方法：半枝蓮粗提物(50 g)用少量純水溶解，上樣于活化后的D101型大孔樹脂進行分離，分別用純水、20%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液進行梯度洗脫，將所得的洗脫液各個組分濃縮成干燥粉末并稱重。其中20%乙醇水溶液洗脫組分命名為樣品A。

有機溶劑萃取分離方法：稱取樣品A (1.0 g)，采用正丁醇∶乙酸乙酯∶水(1∶1∶2，v/v/v)的液相體系(100 mL)進行有機溶劑萃取，分取有機相和水相減壓揮去溶劑并真空干燥至粉末，用15%乙腈/水溶液溶解分別進行HPLC分析。其中有機溶劑萃取的水相命名為樣品B。

HSCCC分離方法：正丁醇-水(1∶1，v/v)系統在室溫下靜置過夜分層，上相為固定相，下相為流動相。以10 mL/min流速將固定相泵入HSCCC中，待分離管中充滿固定相后，開啟主機，設定主機轉速為800 rpm，以1.5 mL/min流速泵入流動相，紫外檢測波長為280 nm，溫度設定為25℃。稱取樣品B (100 mg)，用20 mL分離初始條件溶液溶解，作為待分離樣品溶液，采用HSCCC分離出3個組分，分別為保留時間 113～168 min、168～235 min、固定液；所接的組分中各取出1.5 mL揮去溶劑后溶解于1 mL超純水中備用。

2 結 果

2.1 大孔樹脂分離方法

經過大孔樹脂分離后發現20%乙醇水洗脫物中固形物成分含量較高，固定物質量占上樣量比例為18.4%，半枝蓮中野黃芩苷主要存在于該組分中，具有較大的研究潛力，因此選擇20%乙醇水洗脫物(樣品A)作為后續分離制備的研究對象。

2.2 有機溶劑萃取法

經過有機溶劑萃取后，采用HPLC對樣品A在有機相和水相中分離情況進行了考察，結果如圖1所示：有機溶劑萃取后水相化學組分成分較單一，主成分含量較高，適合在優化的條件下進行HSCCC繼續分離制備。因此選擇有機溶劑萃取的水層(樣品B)作為HSCCC分離對象。

2.3 高速逆流色譜法

對于極性較大的樣品B來說，采用HSCCC進行分離，主要從極性洗脫體系進行優化，應用HSCCC分離樣品B后，固定液組分的HPLC色譜圖譜如圖2所示。

2.4 野黃芩苷結構鑒定

在較優的質譜條件下，對HSCCC分離得到的主成分進行了定性，質譜圖如圖3所示。

圖1 有機溶劑萃取法分離各組分的色譜圖譜

圖2 HSCCC分離后組分HPLC圖譜

圖3 主成分的一級質譜圖(A)和以284.9為母離子的二級質譜圖(B)Fig 3 MS1 (A) and MS2 (B) mass spectrum of the main peak

一級質譜圖中460.7為分子離子峰，為半枝蓮中主要有效成分野黃芩苷的分子離子峰，其中284.9為野黃芩苷元的碎片峰。以分子量284.9為母離子進行二級質譜分析后，發現主要斷裂碎片與王艷萍等[8-9]報道野黃芩苷元碎片斷裂規律基本一致。

另外，通過在相同高效液相色譜條件下與野黃芩苷標準品的色譜保留情況相對照，能夠進一步確定所分離的主成分為野黃芩苷。

3 討 論

本研究所開發的多維分離策略不僅能夠高效、高純度地獲得半枝蓮中的有效成分，而且具有分離流程短，目標明確的特點。在大孔樹脂粗分離和有機溶劑萃取后，半枝蓮中野黃芩苷的成分得到較好富集，采用高速逆流色譜進一步分離后，野黃芩苷的純度得到較大的提高，這顯示出多維分離方法在分離制備半枝蓮中有效物質的優勢。未見有采用這種多維分離策略分離半枝蓮中的野黃芩苷物質的文獻報道。

在主成分結構鑒定過程中，首先采用質譜法初步推測化合物結構，根據一級質譜和二級質譜的碎片特征，并結合文獻報道，推測出所制備的主成分是在半枝蓮生藥材中含量較高的野黃芩苷；然后采用高效液相色譜法將主成分峰與野黃芩苷標準品的保留行為進行對照，結果進一步確定該成分結構為野黃芩苷。

本研究能夠為從半枝蓮中制備高純度野黃芩苷活性成分奠定基礎，所發展的方法能夠對從天然植物中分離制備活性化合物提供有意義的借鑒。

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