金黃色葡萄球菌rep-PCR指紋圖譜分型技術反應條件的優(yōu)化

林 琳，王 晶

(大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 檢驗科， 遼寧 大連 116011)

金黃色葡萄球菌分型方法可分為表型分型和基因分型，隨著分子生物學理論和實驗技術的不斷完善，基因分型技術在判斷院內感染爆發(fā)流行，了解菌株間的相關性，確定傳染源與流行趨勢方面具有重要的意義并被廣泛使用[1]。rep-PCR即重復序列引物聚合酶鏈反應技術是根據(jù)基因組中的重復序列設計引物，擴增重復序列間的片段，通過電泳產(chǎn)生的特異性指紋圖譜鑒別細菌基因組間的差異[2]。主要的重復片段主要分為基因外回文序列(rep)和腸桿菌科基因間重復序列(ERIC)兩種。這種新方法相對于“金標準”的脈沖場電泳，操作簡單易行，在實驗室可廣泛應用。但其結果的重復性和指紋圖譜的清晰程度與實驗條件密切相關。本研究針對兩種不同的實驗引物，以及引物濃度和退火溫度進行優(yōu)化，以期得到最佳的指紋圖譜。

1 材料和方法

1.1 材 料

金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923(本室保藏)；細菌基因組提取試劑盒、溶菌酶(北京天根生化科技有限公司)；Taq 酶、maker及PCR相關試劑(大連寶生物工程有限公司)；相關rep-PCR引物序列(引物rep：TCGCTCAAAACAACGACACC/引物ERIC-Ⅱ:AAGTAAGTGAGTGGGGTGAGCG)(均合成于大連寶生物工程有限公司)。

1.2 細菌基因組DNA的提取

接種菌株于LB培養(yǎng)基中，35 ℃搖床培養(yǎng)18～24 h，收集菌株于EP管中，加入100 U/mL溶菌酶 20 μL，37 ℃孵育破壁30 min以上，按照基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取，最后用100 mL TE buffer 洗脫，-20 ℃低溫保存。

1.3 rep-PCR擴增引物的篩選

根據(jù)參考文獻[3-4],引物ERIC-Ⅱ及引物rep均可以用于rep-PCR的擴增，其反應體系均為：總反應體系25 μL，DNA模板5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL, 25 mmol/L Mg2+2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL, 5 U/μL Taq酶 0.3 μL，100 pmol/μL引物ERIC-Ⅱ 0.2 μL，100 pmol/μL引物REP 0.25 μL，雙蒸水補足。

設定循環(huán)參數(shù)為95 ℃預變性3 min，94 ℃ 60 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.4 rep-PCR反應體系的優(yōu)化

以引物rep作為實驗引物，在不同的引物濃度(0.8、1.0、1.2 pmol/μL)下進行PCR檢測，其他條件一致，在不同的退火溫度下(35、40、45、50、55 ℃)進行PCR檢測，其他條件一致。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像。

2 結 果

2.1 rep-PCR 引物的篩選

分別用引物ERIC-Ⅱ及引物rep對標準菌株ATCC25923進行擴增，可見引物rep擴增出的條帶數(shù)量和亮度均好于引物ERIC-Ⅱ，所以本實驗選用引物rep作為擴增金黃色葡萄球菌的引物，見圖1。

圖1 不同的引物進行rep-PCR擴增Fig 1 The rep-PCR products at different primer

2.2 rep-PCR反應體系的優(yōu)化

2.2.1 引物濃度的優(yōu)化：當引物濃度分別為0.8 pmol/μL，1.0 pmol/μL，1.2 pmol/μL時，均可擴增出較多的條帶，其中以濃度為1.0 pmol/μL時的條帶數(shù)量最多，亮度最強，終選擇引物濃度1.0 pmol/μL為最終的引物濃度。見圖2。

圖2 rep-PCR引物濃度的優(yōu)化Fig 2 The rep-PCR products at different primer concentration

2.2.2 退火溫度的優(yōu)化：當退火溫度為35、40、45、50、55 ℃時，以退火溫度為45 ℃時條帶數(shù)量最多，亮度最強，終選擇以45 ℃為最終的退火溫度。見圖3。

3 討 論

有關基因分型的方法有很多種，包括染色體DNA限制性內切酶的分析、PFGE、REPD、rep-PCR等，每種方法都有其各自的優(yōu)缺點。rep-PCR即重復序列引物聚合酶鏈反應技術，是以基因組的一段重復回文序列為引物，對細菌基因組的DNA進行PCR擴增，根據(jù)得到的指紋圖譜可對細菌進行同源性分析[5]。rep-PCR兩種主要重復序列片段是基因外回文序列(rep)和腸桿菌科基因間重復序列(ERIC)，這兩種引物分別來自肺炎支原體和大腸桿菌的重復序列片段。用引物rep和引物ERIC-Ⅱ分別對金黃色葡萄球菌ATCC25923進行擴增，均可擴增出指紋圖譜，只是數(shù)量和亮度上有所差異，應用引物rep擴增出的條帶數(shù)量和亮度上都好于引物ERIC-Ⅱ，可見引物rep和引物ERIC-Ⅱ均可以用于金黃色葡萄球菌的同源性分析，由于rep-PCR擴增理想的指紋圖譜亮度越高越好,且數(shù)量在6～8條之間，故認為對于金黃色葡萄球菌進行rep-PCR指紋圖譜分析，基因外回文序列(rep)優(yōu)于腸桿菌間重復序列(ERIC)。

圖3 rep-PCR退火溫度的優(yōu)化Fig 3 The rep-PCR products at different annealing temperature1～5：退火溫度分別為35、40、45、50、55 ℃, M:Marker

rep-PCR具有分辨率好，操作簡單易行等優(yōu)點，但也有其局限性，其中主要的原因是結果的重復性與實驗條件密切相關，反應條件不同，所得到的指紋圖譜不同。所以本研究以ATCC25923為模板，對引物濃度以及退火溫度進行優(yōu)化，希望得到最佳的擴增條件。首先，在其他反應條件固定的條件下，引物濃度設為3個梯度進行擴增，分別為0.8、1.0、1.2 pmol/μL，當引物濃度為1.0 pmol/μL時，擴增出的效果最佳；另外退火溫度的高低對擴增的結果也有較大的影響，在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，可以保證引物的目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異擴增[6]，故本研究在其他反應條件固定的情況下，將退火溫度設為35、40、45、50、55 ℃ 5個梯度，當退火溫度為45 ℃時，擴增的條帶數(shù)和亮度均好于其他，高于相關文獻報道[7]。綜上所述，本研究為金黃色葡萄球菌的rep-PCR分型找出了最佳的反應條件，為金黃色葡萄球菌的同源性分析提供了依據(jù)。

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[7] 汪川,余倩,康睿,等.金黃色葡萄球菌REP-PCR指紋圖譜分型方法優(yōu)化[J].中國公共衛(wèi)生,2009,25(11):1354-1356.