間充質干細胞成骨性能的影響因素

謝方南 綜述 康寧 肖苒 審校

間充質干細胞成骨性能的影響因素

謝方南 綜述 康寧 肖苒 審校

間充質干細胞（Mesenchymal stem cell，MSC）因高度的自我增殖與多向分化能力在再生醫學和組織工程領域具有廣闊的應用前景。目前，MSC成骨分化的研究很多，但體外、內的成骨效率仍然較低。因此，提高MSC的成骨性能成為關注熱點。MSC成骨性能受多方面因素的影響，我們從細胞來源、分離純化、誘導策略及血管化等4個方面對影響MSC成骨性能的因素進行綜述。

間充質干細胞 組織工程 細胞來源 分離純化 誘導策略 血管化

組織工程技術為臨床大面積骨缺損的修復提供了新的思路。然而，在基于MSC的組織工程骨缺損修復過程中，MSC的成骨效果并不理想，主要表現為MSC體內、外的成骨效率較低。MSC的成骨性能受多方面因素的影響，本文從細胞來源、分離純化、誘導策略及血管化四個方面對MSC成骨性能的影響作如下綜述。

1 細胞來源對MSC成骨性能的影響

MSC可來源于體內的多種組織，如骨髓、脂肪、肌肉、肝臟、外周血、臍帶、胎盤等，組織來源的不同及供者年齡的差異均會影響其成骨性能。

Pascale等[1]將胎兒骨髓、外周血、肝臟等3種不同組織來源的MSC進行比較，發現骨髓來源的MSC成骨性能最強，外周血來源次之，肝臟來源最弱。Pilz等[2]比較了胎盤、骨髓來源的MSC表面抗原和成骨分化能力，結果顯示骨髓來源MSC的CD146和堿性磷酸酶（ALP）表達水平顯著高于胎盤來源MSC，表現出更高的成骨性能。另外，對臍帶血、脂肪、骨髓等組織來源MSC的成骨性能的比較研究，證實了骨髓來源MSC表現出最高的成骨性能，而脂肪組織來源MSC成骨性最低[3]。

針對39名37～86歲男性骨髓MSC成骨性的比較研究，發現人骨髓MSC成骨性能隨著年齡增加而逐漸降低[4]。Zhang等[5]研究了年齡對C57BL/6鼠骨髓MSC成骨分化性能的影響，發現18周齡以后的C57BL/6鼠其MSC數量與成骨分化能力會隨著年齡增長而顯著下降。Zhou等[6]也報道了17～90歲骨髓捐獻者骨髓MSC成骨性能的變化，發現STRO-1+MSC細胞數量，隨著年齡的增長而顯著減少，成骨相關基因（RUNX2、OSTERIX、ALP、BSP、OC） 的表達以及 ALP 活力明顯降低。

骨髓來源的MSC在骨缺損修復過程中應用最為廣泛。老年患者的骨髓內MSC數量明顯減少、抗氧化能力下降、衰老細胞增多，但增殖分化能力并沒有明顯改變，而且適當刺激仍具有較強的遷移能力。因此，有人提出應增強其向損傷部位的歸巢能力以促進修復[7]。

2 分離純化對MSC成骨性能的影響

目前，大多數研究主要利用MSC貼壁生長的特性對其進行分離純化。這種方法得到的MSC存在高度異質性，其中包括胚胎樣細胞、MSC以及不同程度的定向分化細胞群。不同亞群的細胞具有不同的增殖和分化潛能，其中生存壽命較短、成骨性能較差的細胞將會影響最終的成骨效率。

為了獲取成骨性能優良且生存時間較長的MSC亞群，有研究針對分離方式進行了改進。Liu等[8]將第2代鼠骨髓MSC懸液與二氧化硅顆粒共培養1 h后，利用密度梯度離心法分離出一類高度純化并具有較強成骨分化潛能的MSC亞群（M2），在體外成骨誘導28 d后，96%的M2細胞能合成骨鈣素，ALP活性動態升高并伴有明顯的骨基質鈣化；M2細胞同種異體異位成骨實驗發現，移植12 d后，可以在組織學水平檢測到ALP、骨橋蛋白、骨鈣素以及局部基質的鈣化。Rada等[9]用包被不同抗體（CD29、CD44、CD49d、CD73、CD90、CD105、p75以及STRO-1）的免疫磁珠顆粒，從人脂肪MSC中分選出不同的細胞亞群，發現用抗STRO-1的免疫磁珠分選出的細胞亞群成骨能力最高，抗CD90、抗CD49d以及抗p75分選出的細胞也具有較高的成骨分化能力。此外，對流離心洗脫法可在原代人臍帶MSC中分離出一種細胞直徑在11 μm左右的細胞群，流式細胞分選發現這種細胞群高表達CD44、CD73、CD90及CD105等干細胞標記物，并且比其他細胞亞群更年輕、增殖能力更強，有可能成為另一應用前景廣闊的MSC 來源[10]。

用這些方法都能使MSC成骨性能得到一定程度的提高，但是由于目前仍然缺乏MSC及其定向分化的特異性標志物，MSC及不同亞群的分離純化技術仍未取得突破性進展。

3 誘導策略對MSC成骨性能的影響

基于MSC的骨缺損治療，有研究認為，適當的體外誘導可促進MSC的體內成骨效率[11－12]。根據骨發生過程中膜內成骨和軟骨內成骨兩種方式，對MSC體外誘導主要有成骨誘導與成軟骨誘導兩種策略。

3.1 成骨誘導

研究發現，將成骨細胞接種于陶瓷支架可使其通過膜內成骨的方式生成骨組織[13]。因此，通常在體外對MSC成骨誘導2～3周，使其轉化為穩定成骨表型之后，再應用于組織工程骨的構建。Eslaminejad等[14]將犬MSC體外成骨誘導3周后，進行光學和透射電鏡觀察，并檢測ALP及軟骨相關基因的表達，鏡下可見很多類似于板層骨結構的骨結節樣細胞團，表面覆蓋一層骨膜樣結構，細胞團中發現不同形態的類骨細胞以及垂直排列的膠原纖維束，但未檢測到軟骨相關基因的表達。

3.2 成軟骨誘導

研究表明，未經誘導的MSC植入體內后也可通過軟骨內骨化的方式成骨[13]。因此，適當的體外成軟骨誘導可能會有助于軟骨內骨化的發生。Janicki等[15]對人骨髓MSC體外成軟骨誘導促進軟骨內成骨的方式進行了研究。他們將MSC種植在β-TCP支架上，其中一組復合物經過體外成軟骨誘導6周后植入裸鼠皮下，另一組未經任何誘導后植入。植入8周后組織學檢測發現：未經誘導的MSC/β-TCP復合物表現出膜內成骨的現象，未發現骨髓樣組織；而經過成軟骨誘導的MSC/β-TCP復合物體外形成了富含Ⅱ型膠原和蛋白多糖的軟骨樣組織，皮下移植后形成了大量的異位骨，通過原位雜交技術進一步發現新生骨主要是由供者MSC產生，且發現有來源于受體鼠的骨髓結構形成。有研究進一步證實了MSC體外成軟骨誘導能促進軟骨內骨化的發生[16－17]。Scotti等[18]認為MSC向肥大軟骨細胞轉化，是軟骨內骨化發生的一個必要過程，在體外將MSC誘導成肥大軟骨細胞能顯著促進其體內軟骨內骨化過程。此外，Farrell等[19]認為MSC通過軟骨內成骨的方式更有利于新生骨組織的血管化。

MSC體外成骨與成軟骨誘導均可促進其體內成骨，但是兩種方法成骨效率的比較，仍有待于進一步研究。

4 血管化對MSC成骨性能的影響

在組織工程骨修復缺損的過程中，充足的血液供應能為骨缺損部位微環境提供大量的成骨祖細胞、信號分子以及營養供應，同時能帶走代謝廢物與各種降解產物，有助于建立良好的再生微環境。而MSC支架材料復合物植入后能否成功地介導骨生成主要取決于MSC的生物學活性，血液供應不足將會影響其增殖、分化及分泌功能，導致成骨量降低。因此，血管化在MSC成骨過程中至關重要。目前主要通過血管內皮細胞、血管生成因子以及外科手段血管預置等方法，來促進MSC成骨過程中的血管化。

4.1 血管內皮細胞

血管內皮細胞是目前研究最多的血管生成細胞，大量的研究報道顯示，血管內皮細胞能與不同組織來源的MSC體外共培養生成血管樣結構。Verseijden等[20]將人脂肪MSC與人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）以2:8比例進行三維共培養，成功地實現了脂肪MSC支架復合物體外預血管化，植入裸鼠皮下明顯提高了新生血管形成的數量，并且能整合至宿主血管系統。

在人骨髓MSC與HUVECs共培養的過程中發現，內皮細胞不僅能促進血管生成，而且能使MSC成骨標記物ALP的活性提高4倍以上[21]。Liu等[22]將人臍靜脈內皮細胞與成骨誘導后的人骨髓MSC以1:1進行共培養，結果表明，臍靜脈內皮細胞能顯著增強骨髓MSC的成骨礦化能力。Saleh等發現，HUVEC條件培養基（HUVEC-CM）能夠顯著提高人骨髓MSC中ALP的表達水平、礦化結節的數量以及成骨相關標志基因ALP、BMP-2、ON與OPN的表達水平，并且在HUVEC與人骨髓MSC三維共培養的實驗中證實了這種成骨促進作用，并發現成骨誘導培養條件下HUVEC能增強pSmad 1/5/8的表達水平，激活骨形態發生蛋白（BMP）信號通路，促進骨生成。

臍靜脈內皮細胞是多數研究中主要的血管內皮細胞來源，然而與宿主的免疫不相容性，使其很難進入臨床應用。因此，有研究認為，自體脂肪組織來源的微血管內皮細胞和外周血來源的內皮祖細胞，有可能成為新的內皮細胞來源[23-25]。

4.2 血管生成因子

血管內皮生長因子 （VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）是兩個強有力的血管生成促進因子[26－27]，對MSC血管微環境的形成至關重要。Huang等[28]在基于骨髓MSC骨組織再生的研究中發現，加入VEGF后能顯著增加新生血管的生成及骨組織形成量。Singh等[29]將外源性的VEGF結合至膠原包被的聚已酸內酯（PCL）支架，結果顯示，VEGF對支架植入后早期血管生成有顯著促進作用。VEGF與PDGF不僅能增加新生血管形成而且還能對MSC的增殖、分化等進行調節。Alimonte等[30]發現VEGF能促進人牙髓MSC的體外增殖以及成骨分化性能。Caplan等[31]認為PDGF一方面通過增強MSC對成骨因子BMP等的敏感性來促進MSC成骨分化，另一方面通過刺激血管周細胞分泌VEGF來促進血管生成，更可誘導血管周細胞對新生血管的再貼附，具有穩定新生血管的作用。

堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）在基于MSC的骨再生過程中也具有促進骨生成及血管化的作用[32－33]。Jiang等[34]用bFGF基因轉染的骨髓MSC注入至經成骨牽引的新西蘭兔下頜骨牽引間隙中，發現bFGF轉染的骨髓MSC成骨量、骨密度以及骨礦物含量顯著高于對照組。Chen等[35]認為bFGF能增高成骨分化因子及ALP的mRNA表達水平，促進MSC體內成骨量及血管化水平。

VEGF、PDGF及bFGF等血管生成因子在促血管、促成骨方面的作用已經得到認可，但在應用過程中很難控制釋放的穩定性。因此，尋找合適的支架材料來介導其在特定的時空內穩定釋放成為了新的難題。

4.3 血管預置

為了使組織工程復合物得到更好的血液供應，有研究提出用外科手段進行血管預置，以促進血管化進程。Cai等[36]以隱靜脈為蒂，使其緊貼于BMSC-珊瑚羥基磷灰石（CHA）支架復合物表面，以達到預血管化目的。手術植入4周后檢測發現，BMSC-CHA復合物中形成了規則的血管網絡，且前3個月成骨總量比未血管化組高1倍。Zhao和Kawamura等[37-38]分別使橈動靜脈與隱動靜脈從BMSC支架復合物中間穿過，并將其遠端結扎，成功將其預血管化，并發現這種血管預置方法能明顯促進支架中血管的長入，增強骨缺損的修復效果，提高BMSC支架復合物ALP的活性及骨鈣素的含量。此外，有研究發現，用動靜脈環路的方法預置血管，也能增強組織工程復合物中血管的長入，提高MSC最終的成骨效果[39]。

血管預置的方法能明顯促進組織工程血管化及骨組織的生成，對臨床大面積骨缺損的修復意義重大。各種血管預置的方法，如動靜脈束、動靜脈束末端結扎、動靜脈環路等均具有促血管生成的作用，但提高MSC成骨性能及骨缺損修復能力仍有待進一步探討。

MSC是骨缺損修復中重要的種子細胞，骨缺損治療的最終效果由影響MSC成骨的各種因素共同決定。根據需求選擇最佳種子細胞來源、優化的MSC分離純化方式、恰當的體外擴增及誘導方案，以及體外、體內血管化的建立和維持等均會影響MSC最終的成骨效果。

未來的研究方向主要有探索具備優良成骨性能MSC亞群的特異性標志物、建立高效純化的分離方式、綜合利用影響MSC成骨性能的各種因素模擬其成骨發育微環境，使之充分發揮自身的成骨性能，為提高臨床基于MSC的骨缺損治療效果提供理論基礎及優化方案。

[1]Guillot PV,De Bari C,Dell’Accio F,et al.Comparative osteogenic transcription profiling of various fetal and adult mesenchymal stem cell sources[J].Differentiation,2008,76(9):946-957.

[2]Pilz GA,Ulrich C,Ruh M,et al.Human term placenta-derived mesenchymal stromal cells are less prone to osteogenic differentiation than bone marrow-derived mesenchymal stromal cells[J].Stem Cells Dev,2011,20(4):635-646.

[3]Shafiee A,Seyedjafari E,Soleimani M,et al.A comparison between osteogenic differentiation of human unrestricted somatic stem cells and mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue[J].Biotechnol Lett,2011,33(6):1257-1264.

[4]Mueller SM,Glowacki J.Age-related decline in the osteogenic potential of human bone marrow cells cultured in three-dimensional collagen sponges[J].J Cell Biochem,2001,82(4):583-590.

[5]Zhang W,Ou G,Hamrick M,et al.Age-related changes in the osteogenic differentiation potential of mouse bone marrow stromal cells[J].J Bone Miner Res,2008,23(7):1118-1128.

[6]Zhou S,Greenberger JS,Epperly MW,et al.Age-related intrinsic changes in human bone-marrow-derived mesenchymal stem cells and their differentiation to osteoblasts[J].Aging Cell,2008,7(3):335-343.

[7]Kasper G,Mao L,Geissler S,et al.Insights into mesenchymal stem cell aging:involvement of antioxidant defense and actin cytoskeleton[J].Stem Cells,2009,27(6):1288-1297.

[8]Liu H,Toh WS,Lu K,et al.A subpopulation of mesenchymal stromal cells with high osteogenic potential[J].J Cell Mol Med,2009,13(8):2436-2447.

[9]Rada T,Reis RL,Gomes ME.Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential[J].Stem Cell Rev,2011,7(1):64-76.

[10]Majore I,Moretti P,Hass R,et al.Identification of subpopulations in mesenchymal stem cell-like cultures from human umbilical cord[J].Cell Commun Signal,2009,7:6.

[11]Pioletti DP,Montjovent MO,Zambelli PY,et al.Bone tissue engineering using foetal cell therapy[J].Swiss Med Wkly,2007,137(155):86-89.

[12]Weissman IL.Translating stem and progenitor cell biology to the clinic:barriers and opportunities[J].Science,2000,287(5457):1442-1446.

[13]Tortelli F,Tasso R,Loiacono F,et al.The development of tissueengineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model[J].Biomaterials,2010,31(2):242-249.

[14]Eslaminejad MB,Taghiyar L.Study of the structure of canine mesenchymal stem cell osteogenic culture[J].Anat Histol Embryol,2010,39(5):446-455.

[15]Janicki P,Kasten P,Kleinschmidt K,et al.Chondrogenic preinduction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP:enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation[J].Acta Biomater,2010,6(8):3292-3301.

[16]Pelttari K,Winter A,Steck E,et al.Premature induction of hypertrophy during in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stem cells correlates with calcification and vascular invasion after ectopic transplantation in SCID mice[J].Arthritis Rheum,2006,54(10):3254-3266.

[17]Farrell E,Both SK,Odorfer KI,et al.In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells[J].BMC Musculoskelet Disord,2011,12(31):1471-2474.

[18]Scotti C,Tonnarelli B,Papadimitropoulos A,et al.Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(16):7251-7256.

[19]Farrell E,van der Jagt OP,Koevoet W,et al.Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells:a better route to bone repair[J]?Tissue Eng Part C Methods,2009,15(2):285-295.

[20]Verseijden F,Posthumus-van Sluijs SJ,Farrell E,et al.Prevascular structures promote vascularization in engineered human adipose tissue constructs upon implantation[J].Cell Transplant,2010,19(8):1007-1020.

[21]Rouwkema J,Boer J,Van Blitterswijk CA.Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct[J].Tissue Eng,2006,12(9):2685-2693.

[22]劉春曉,吳歡歡,馬慧雨,等.人骨髓間充質干細胞與臍靜脈內皮細胞體外共培養的研究[J].組織工程與重建外科雜志,2011,7(2):65-69.

[23]Hewett PW,Murray JC,Price EA,et al.Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,1993,29(4):325-331.

[24]Supp DM,Wilson-Landy K,Boyce ST.Human dermal microvascular endothelial cells form vascular analogs in cultured skin substitutes after grafting to athymic mice[J].FASEB J,2002,16(8):797-804.

[25]Urbich C,Dimmeler S.Endothelial progenitor cells:characterization and role in vascular biology[J].Circ Res,2004,95(4):343-353.

[26]Richardson TP,Peters MC,Ennett AB,et al.Polymeric system for dual growth factor delivery[J].Nat Biotechnol,2001,19(11):

1029-1034.

[27]Chen RR,Silva EA,Yuen WW,et al.Spatio-temporal VEGF and PDGF delivery patterns blood vessel formation and maturation[J].Pharm Res,2007,24(2):258-264.

[28]Huang YC,Kaigler D,Rice KG,et al.Combined angiogenic and osteogenic factor delivery enhances bone marrow stromal cell-driven bone regeneration[J].J Bone Miner Res,2005,20(5):848-857.

[29]Singh S,Wu BM,Dunn JCY.Delivery of VEGF using collagencoated polycaprolactone scaffolds stimulates angiogenesis[J].J Biomed Mater Res A,2012,100(3):720-727.

[30]Alimonte ID,Nargi E,Mastrangelo F,et al.Vascular endothelial growth factor enhances in vitro proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells[J].J Biol Regul Homeost Agents,2011,25(1):57-69.

[31]Caplan AI,Correa D.PDGF in bone formation and regeneration:new insights into a novel mechanism involving MSCs[J].J Orthop Res,2011,29(12):1795-1803.

[32]Kurane A,Simionescu DT,Vyavahare NR,et al.In vivo cellular repopulation of tubular elastin scaffolds mediated by basic fibroblast growth factor[J].Biomaterials,2007,28(18):2830-2838.

[33]Pacicca DM,Patel N,Lee C,et al.Expression of angiogenic factors during distraction osteogenesis[J].Bone,2003,33(6):889-898.

[34]Jiang X,Zou S,Ye B,et al.bFGF-Modified BMMSCs enhance bone regeneration following distraction osteogenesis in rabbits[J].Bone,2010,46(4):1156-1161.

[35]Chen M,Song K,Rao N,et al.Roles of exogenously regulated bFGF expression in angiogenesis and bone regeneration in rat calvarial defects[J].Int J Mol Med,2011,27(4):545-553.

[36]Cai L,Wang Q,Gu C,et al.Vascular and micro-environmental influences on MSC-coral hydroxyapatite construct-based bone tissue engineering[J].Biomaterials,2011,32(33):8497-8505.

[37]Zhao M,Zhou J,Li X,et al.Repair of bone defect with vascularized tissue engineered bone graft seeded with mesenchymal stem cells in rabbits[J].Microsurgery,2011,31(2):130-137.

[38]Kawamura K,Yajima H,Ohgushi H,et al.Experimental study of vascularized tissue-engineered bone grafts[J].Plast Reconstr Surg,2006,117(5):1471-1479.

[39]Eweida AM,Nabawi AS,Marei MK,et al.Mandibular reconstruction using an axially vascularized tissue-engineered construct[J].Ann Surg Innov Res,2011,5:2.

Influence Factors on Osteogenic Potential of Mesenchymal Stem Cells

XIE Fangnan,KANG Ning,XIAO Ran.Research Center of Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100144,China.

XIAO Ran(E－mail:xiaoran@pumc.edu.cn).

Mesenchymal stem cell;Tissue engineering;Cell source;Isolation and purification;Induction strategy;Vascularization

Q813.1+2

B

1673－0364（2012）04－0225－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.013

國家自然科學基金面上項目（30871433，31071305）。

100144 北京市 中國醫學科學院整形外科研究所。

肖苒（E－mail:xiaoran@pumc.edu.cn）。

【Summary】Mesenchymal stem cell(MSC)has broad prospects in the field of regenerative medicine and tissue engineering due to its highly self-renewal and multi-lineage differentiation ability.Although there are many researches about MSC osteogenic differentiation,its osteogenic efficiency is still very low both in vitro and in vivo.Therefore,how to improve the MSC osteogenic performance has become the focus of researchers.MSC osteogenic performance is influenced by many factors.In this review,the influence factors are discussed from four aspects:cell sources,approaches of isolation and purification,induction strategies and vascularization.

2012年5月29日；

2012年7月2日）