溶血對電化學發光免疫法測定胰島素和C-肽的影響

鄭慕陽 陳海斌 梁業斌

糖尿病(diabetes mellitus，DM)實驗室分型診斷主要依靠胰島素及C-肽(C-P)釋放試驗，1型DM表現為胰島B細胞破壞導致胰島素絕對缺乏，2型DM則表現為胰島素抵抗為主伴胰島素分泌不足，或胰島素分泌不足為主伴或不伴有胰島素抵抗[1]。在日常工作中經常會遇到不同程度的溶血標本[2]，鑒于臨床對DM患者診斷、治療、監測及預后判斷的需要，準確了解標本溶血對胰島素及C-肽測定的干擾尤為必要。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

采用德國Roche公司的E601全自動電化學發光免疫分析儀及配套的胰島素及C-肽檢測試劑盒。

1.2 不同程度溶血標本的制備

為了使胰島素和C-肽達到一定的測定濃度，抽取體檢者餐后1 h靜脈血液，一針兩管，分別注入帶分離膠的促凝試管。其中一管經37 ℃水浴30 min后以4000 r/min、離心半徑為17.5 cm進行離心10 min，作為非溶血標本；另一管放置-20 ℃冰箱保存2 h后取出融化，以4000 r/min、離心半徑17.5 cm進行離心10 min，分離溶血血清。用SYSMEX XT-1800i全自動血液分析儀測量血紅蛋白(Hb)質量濃度，然后將溶血血清與非溶血血清按不同比例混合，得到血紅蛋白(Hb)質量濃度為10 g/L、5 g/L、2.5 g/L、1.2 g/L 5、0.625 g/L的溶血標本。

1.3 測量方法

室溫(20 ℃)環境下分為4個時間段(0、30 min、60 min、120 min)，分別測定溶血和非溶血標本的胰島素及C-肽濃度。

1.4 溶血或時間因素對測定干擾的評價方法

按下式評價溶血或時間因素對測定結果的影響：

式中：|F|：溶血或時間因素引起的誤差；X：溶血標本或放置一定時間后待測物濃度；X0非溶血血清待測物濃度。若|F|＞0.10，表示溶血干擾客觀存在，如|F|＜0.10，表示溶血干擾輕微，可以忽略不計[3]。

2 結果

標本溶血可使胰島素濃度降低，溶血程度越大、標本放置時間越長，胰島素濃度下降越明顯，胰島素濃度測定與標本溶血程度及放置時間呈負相關；標本溶血對電化學發光免疫法測定血C-肽無干擾。結果見表1、表2。

表1 不同時間段不同程度溶血標本的胰島素濃度(uIU/ml)

表2 不同時間段不同程度溶血標本的C-肽濃度(pmol/ml)

3 討論

胰島素由胰島B細胞合成和分泌，其分子量約為6000，由α、β2條肽鏈構成的一種多肽，是人體內惟一降低血糖的激素。它能增加細胞膜對葡萄糖、氨基酸及鉀離子通透性，促進葡萄糖的利用。胰島素分泌主要受血中葡萄糖濃度的調節，當血中葡萄糖濃度升高，可刺激胰島素的分泌。C-肽由31個氨基酸殘基組成，胰島素在胰島B細胞形成之前，先在細胞內合成胰島素原，并進而分解成等分子的C-肽和胰島素[4]。理論上血清中的C-肽和胰島素成一定比例關系，但C-肽不被肝臟破壞，在外周血中其分子濃度比胰島素高約5倍，半衰期約為胰島素的2倍多，并且藥用胰島素中不含C-肽，外源性抗體均不影響C-肽的測定。因此，對于接受胰島素治療的患者測定C-肽更能精確地判斷胰島B細胞的合成與釋放胰島素的功能水平[5]。

目前，測定胰島素和C-肽的主要方法有放射免疫分析(RIA)、時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)、酶免疫分析(EIA)、化學發光免疫分析(CLIA)以及電化學發光免疫分析法(ECLIA)。由于RIA法報告時間長、結果不穩定并且存在同位素污染的問題，已趨于淘汰；酶免疫分析法雖然克服了放射免疫分析中放射性污染的弊端，具有設備簡單，操作安全等優點，但這種依靠比色法或偏振光法的檢測技術存在酶不穩定、光度測量范圍窄、靈敏度不高、難以定量、易造成漏診和假陽性等不足，受到了應用上的限制；時間分辨熒光免疫分析、化學發光免疫分析及電化學發光免疫分析法具有靈敏度高、特異性強、所用試劑具有良好的穩定性、檢測范圍較寬、儀器能實現自動化、不污染環境以及能消除常規熒光測定中的高背景等優點，是非放射免疫分析中很有發展潛力的分析方法。但有研究表明，不同的分析方法對溶血的抗干擾能力不同，采用競爭分析法的放射免疫分析較采用雙抗體夾心法的電化學發光免疫分析法在測定胰島素時對溶血的抗干擾能力更強[6-7]。

通常正常人及2型DM患者的胰島素及C-肽釋放曲線如圖1、圖2所示。即正常人血清胰島素和C-肽均是空腹最低，餐后1 h最高，2 h次之，3 h接近空腹水平，而DM患者則表現為逐步上升的趨勢，即：空腹低，1 h較高，2 h最高，3 h次高甚至最高[4]。魏子坤等[8]研究表明，在可疑人群中即使其糖耐量完全正常，但胰島素和C-肽分泌異常者，如果不進行胰島素和C-肽釋放試驗將會降低診斷的準確性，加大漏診率。

圖1 INS釋放曲線

圖2 C-肽釋放曲線

4 結語

由于紅細胞中含有胰島素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE)是一種過氧化物水解酶，能夠高效、特異地降解胰島素，被認為是在細胞水平降解胰島素最主要的酶，隨著紅細胞的破壞，其內存的IDE釋放進入血清，能導致溶血標本胰島素濃度降低。本實驗顯示，標本溶血對電化學發光免疫分析法測定C-肽無干擾；溶血標本的胰島素測定結果與溶血程度及放置時間呈負相關[9-10]。在測定胰島素釋放試驗時，任何時間段的標本溶血均可對釋放曲線的高低和走向產生影響，例如空腹階段標本溶血造成的胰島素降低可能會被誤診成1型DM，正常人1 h階段標本溶血造成的胰島素降低有可能誤診成2型DM等等，從而給臨床醫師的診斷和治療帶來困惑。因此，檢驗師做胰島素測定時要絕對避免溶血，在臨床中遇到不可避免的溶血標本時應在報告單上注明。臨床醫師面對胰島素釋放曲線和C-肽釋放曲線不相符情況下有必要與實驗室溝通以排除標本因素的干擾。子能出版社,1991:190.

[6]沈云峰,胡遠貴.溶血對電化學發光免疫分析法測定胰島素的干擾[J].檢驗醫學,2007,22(3):359-360.

[7]Cheyenne D,LetaiUerur A,Trivin F,et a1.Effect of hemolysis on the concentration of insulin in serum determined by RIA and IRMA[J].Clin Chem,1998,44(2):354-356.

[8]魏子坤,楊小麗,田竹芳.OGTT、IRT和CPRT聯檢在DM2診治中的價值[J].放射免疫學雜志,2006,19(1):11-13.

[9]Sapin R,Ongagna JC,Gasser F,et a1.Insulin measurements in haemolysed serum:influence of insulinase inhibltors[J].Clin Chim Acta,1998,274(1):111-117.

[10]Sapin R.Interference of hemolysis and hemoglobin：example of insulin assay[J].Ann Biol Clin,2001,59(1):113-114.