熱休克蛋白-肽復合物與腫瘤免疫

牛保華，齊義軍，晁瑋霞，馬遠方

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一類在生物進化過程中高度保守，廣泛表達于所有生命機體組織細胞并具有管家功能的蛋白質。根據分子量的差異，HSP 可分為10個家族，包括 HSP110/grp170、gp96/grp94、HSP90、HSP70/grp78、HSP65、HSP25/27等，每個家族有 1～5個成員[1]。在正常生理狀態下，HSP的結構性表達約占細胞蛋白質組的5%。HSP 作為分子伴侶，參與蛋白折疊、蛋白降解、蛋白復合體組裝、轉運、抗原處理、蛋白定位等生物學過程。高溫、毒素、氧化、糖原耗竭等應激狀態可誘導 HSP的表達上調，高表達的HSP 可達細胞蛋白質組的15%，增加的HSP能夠快速短暫地保護細胞免受損傷，增加細胞的修復功能，維持應激狀態下細胞中關鍵分子通路的完整性[2]。近年來發現 HSP 與腫瘤免疫密切相關，本文就 HSP-肽復合物抗腫瘤的分子免疫機制及以 HSP 為免疫佐劑的腫瘤疫苗作一綜述。

1 HSP-肽復合物免疫原性

某些 HSP能夠結合細胞內降解的許多肽段構成 HSP-肽復合物，如位于胞漿的HSP90和HSP70 及位于內質網的gp96、calreticulin、HSP110和HSP170。HSP-肽復合物相當穩定，可以耐受常規的生化、物理分離純化過程，HSP-肽復合物通常攜有大量的非共價結合的多肽分子[2]。因此，熱休克蛋白相結合的肽庫在一定程度上代表了其來源組織細胞的蛋白構成。

HSP-肽復合物具有免疫原性，從腫瘤或病毒感染的組織細胞中分離純化的HSP能夠刺激機體產生特異性免疫應答反應，而來源于正常組織的HSP 卻沒有這種功能。HSP-肽復合物的抗腫瘤活性起始于gp96，之后發現HSP70、HSP90、calreticulin、HSP110 及GRP170 均具有這種特異的免疫防御功能。從 HSP 中解離出其結合的多肽分子后，會導致 HSP 免疫保護功能完全喪失，體外重組的HSP-多肽復合分子具有相同的免疫保護功能[3]。越來越多的證據充分證實：HSP的免疫原性來源于HSP結合的腫瘤或病毒感染的細胞內蛋白降解生成的多肽，而不是 HSP 分子本身所具有的功能，從腫瘤組織細胞分離純化 HSP的生物化學過程并沒有影響到 HSP的分子伴侶功能[4]。在免疫原性方面，gp96和HSP70 誘導的免疫保護反應強于其他的HSP 分子，而 gp96 在誘導機體抗原特異性細胞毒淋巴細胞（CTL）反應能力方面優于其他同類分子[3]。

2 HSP-肽復合物誘導腫瘤特異性免疫的分子機制

一般來講，內源性抗原是通過 MHC I 類分子提呈，外源性抗原通過 MHC II 類分子提呈。在HSP-肽復合物誘導腫瘤特異性免疫反應過程中，HSP 發揮了中轉作用，對細胞漿來源的多肽進行處理后轉運至內質網，然后介導 MHC I 類分子與抗原肽結合，屬于抗原交叉提呈范疇[5]。最近的研究表明：抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APC）表面的HSP 受體，如 CD91、LOX1、SR-A等，在識別與內吞 HSP-抗原肽復合物、抗原的交叉呈遞至 MHC 分子過程中起著關鍵作用。gp96-肽復合物并不能直接激活 T 細胞，而是通過巨噬細胞、樹突狀細胞（dentritic cells，DC）及B 細胞等 APC 表面的CD91 受體介導，受體-gp96-抗原肽復合物被內吞后進入 APC的內體，內體中的低 pH環境可能促進了抗原肽解離，gp96 與MHC I 類分子的相互作用激活了 gp96的ATP 酶活性，ATP 水解釋放的能量使抗原肽由 gp96 轉移到 MHC I 類分子[6]。此外，gp96 還能誘導 DC的成熟并同時下調 DC 表面的受體，使 DC失去了與gp96結合的能力，成熟的DC能直接刺激 T 細胞，啟動 CTL 效應[7]。

與MHC 類分子類似，HSP能夠結合細胞內的抗原肽。但與MHC 分子不同的是，由于HSP 沒有多態性，即正常組織與疾病組織中的HSP的基因序列并沒有差異。因此，與HSP 相互作用的多肽更廣泛、不受 MHC 限制，能結合MHC 類分子之外更多的多肽分子[8]。此外，HSP 還能促進APC的表型和功能成熟，如 HSP 刺激后DC 表面 MHC II 類分子、CD86和CD83等分子的表達上調，以及細胞因子和化學因子等前炎癥因子的分泌增加[2,9]。HSP70-和gp96-肽復合物還能刺激自然殺傷細胞增殖并使其激活[10]。因此，HSP 分子除了擔當抗原肽的載體，還具有免疫佐劑的免疫刺激功能，同時誘導天然性和適應性免疫應答，故HSP 用于腫瘤的免疫治療具有無可替代的優勢。

3 HSP-肽復合物腫瘤疫苗及臨床應用

由于HSP 介導的抗腫瘤效應來源于其結合的抗原肽，因而體外重組的HSP-抗原肽復合物亦能激發機體產生類似的特異性的腫瘤清除反應。與MHC 分子結合的多肽分子不同，HSP結合的多肽非常廣泛，不受抗原肽表位的影響，因而具有廣闊的應用前景[2]。由 gp96 介導的免疫反應所需多肽的量極少，研究表明 1～2 ng人工合成的多肽與gp96結合后，一方面既可交叉呈遞給 MHC I 類分子啟動CD8+ T 細胞反應，另一方面還能提呈抗原到 MCH II 類分子，最終刺激機體產生有效的腫瘤特異的免疫反應[3,5]。

故而，基于HSP-多肽復合物的腫瘤特異性疫苗為腫瘤免疫治療提供了廣闊的應用前景，其具有 3個顯著的優點：①HSP 介導的免疫殺傷作用并不需要對免疫性多肽的表位進行鑒定，而臨床上腫瘤患者有著不同的個體差異，這樣就免除了對不同類型和不同個體的腫瘤的免疫保護抗原進行鑒定的必要；②來自于腫瘤的HSP-抗原肽復合物包含有大量不同的免疫原性多肽，因而其介導的免疫防御反應針對的是腫瘤組織細胞中所有特異的抗原庫，降低了免疫逃逸發生的可能性；③同一種屬內 HSP 沒有多態性，不受 MHC I類抗原限制，可在同種內廣泛應用。在小鼠和大鼠的腫瘤模型中，當 HSP 復合物介導的免疫治療作為輔助手段時，在腫瘤被完全切除之后，所有的接受 HSP 復合物免疫治療的動物在整個實驗過程中都能保持無瘤狀態；但對沒有切除、進展性的腫瘤，僅能維持腫瘤的穩定，僅少數病例可見腫瘤實體的縮小[2]。

基于HSP-多肽復合物的廣譜抗腫瘤活性，這種輔助治療手段的適應癥包括了各種組織類型的腫瘤。目前已有多個應用自體純化的HSP-肽復合物對腫瘤進行免疫治療的I和II 期臨床試驗，具有一定的療效。gp96-肽復合物疫苗已應用于多種不同組織類型的腫瘤，如胰腺癌、胃腸道腫瘤、淋巴組織腫瘤、慢性骨髓性白血病、腎癌及皮膚的黑色素瘤等[11]。

自最初發現 gp96-肽復合物抗腫瘤活性后，已有許多自體腫瘤組織 gp96-肽復合物提取物對腫瘤患者治療的臨床試驗。應用自體腫瘤 gp96-肽復合物提取物治療黑色素瘤患者的臨床 II 及III 期試驗，目前已有 4 篇報道。di Pietro等[12]綜合分析后發現：自體免疫后腫瘤特異性 CTL 反應增強患者的預后顯著好轉，gp96-肽復合物與其他免疫治療方案結合后療效更為顯著。20 例晚期黑色素瘤已發生多處轉移的患者，25 μg 自體 gp96-肽復合物皮內注射作為黑色素瘤輔助治療，經過 10年隨訪 11 例IV 期患者發現：45%的患者疾病沒有進展，10年整體生存率為82%[13]。對發生了肝轉移的29 例結腸癌患者，應用手術切除的肝轉移灶標本制備自體 gp96-肽復合物腫瘤疫苗，經過兩個周期的治療，患者外周血淋巴細胞的酶聯免疫斑點法（ELISPOT）檢測顯示：15 例（52%）患者激發了新的HLA I 限制性特異性殺傷結腸癌細胞的CTL 反應或原有的CTL 反應顯著增強；同時，這些患者外周血中 CD3+、CD45RA+和CCR7-T 淋巴細胞明顯增加；結腸癌特異性 CTL 反應增加患者無瘤生存期較無反應者明顯延長[14]。國內學者也應用HSP-肽復合物治療 32 例原發性肝癌患者，結果顯示：治療 3個月后，治療組的CD3+、CD8+ 細胞明顯升高，CD4+/CD8+ 細胞的比值下降，NK 細胞的活性也較治療前顯著增強；治療組的3年生存率為68.8%，較對照組的37.5% 明顯升高[15]。此外，還有學者利用 DNA-HSP65 腫瘤疫苗治療晚期頭頸部鱗癌，21 例患者被分為3組，分別接受 3個劑量瘤體內注射，治療一個周期（3周）后，發現 4 例可檢測到外周血淋巴細胞分泌 IL-10 增加，5 例患者治療后病情穩定或腫瘤消退，2 例完成治療的患者 3年后仍存活，提示 HSP是腫瘤治療的新靶點，具有美好的應用前景[16]。也有學者應用 gp96-肽復合物免疫治療神經膠質瘤患者，無論是對于復發還是新近診斷的膠質瘤患者，治療組的中位生存期均從 26周增至 44周。

目前為止已完成了多個 HSP-多肽復合物治療多種腫瘤臨床試驗，但均不是隨機臨床試驗；盡管如此，腎癌、胰腺癌和黑色素瘤的HSP-多肽復合物免疫治療顯示了較好的臨床療效，與動物模型觀測的結果一致[2]。以上結果提示HSP-肽復合物腫瘤疫苗能有效地治療特定腫瘤、降低術后復發率。

4 重組多價 HSP-肽復合物腫瘤疫苗

然而，個體化的HSP-肽復合物腫瘤疫苗并不適用于所有的腫瘤患者，尤其是無手術機會及術后復發轉移的晚期患者，腫瘤患者不能提供足夠腫瘤組織以制備自體腫瘤疫苗，供自體長期治療使用。其次，腫瘤組織來源有限，繁雜的純化制備過程難以標準化及質量控制，既是制備自體疫苗所面臨的挑戰，還阻礙了其大規模生產。第三，HSP-抗原肽復合物半衰期較短，阻止了腫瘤疫苗的長期使用。

相對腫瘤患者自體來源的HSP-肽復合物疫苗，體外重組HSP-肽復合物疫苗具有無可比擬的優點：①HSP 高效結合的肽類分子所構成的復合物疫苗可高濃度刺激機體的免疫系統，啟動免疫應答；②HSP 可結合多個具有不同 CTL表位的抗原肽，供個體的抗原提呈細胞的MHC 分子選擇，產生針對不同抗原表位的多克隆 T和（或）B 細胞的抗腫瘤效應，降低免疫逃逸的發生；③重組HSP-肽疫苗仍適用于不能提供腫瘤組織的晚期、術后復發癌癥患者，尤其適用于腫瘤易患人群或術后高復發轉移傾向的患者的預防性治療；④重組HSP-肽腫瘤疫苗生產成本低，可大規模、高質量的工業化生產；⑤選擇不同 HLA 限制性的免疫優勢CTL 表位肽構成多價重組疫苗而非整個腫瘤組織或細胞，有益于更好地理解認識重組HSP 疫苗的腫瘤特異性免疫反應的分子機制。

5 結語

由于腫瘤細胞遺傳的不穩定性，腫瘤患者確診時其腫瘤細胞/組織內已發生了約 10000的基因突變等分子事件；由基因突變導致異常蛋白的數量更多。同時，隨著腫瘤進展，腫瘤細胞為了適應周圍惡劣的微環境，如低氧、酸性環境、腫瘤患者治療過程中的放化療等，發生惡性變的細胞需要大量伴侶蛋白的保護功能，使細胞能夠繼續生存，因而，細胞內伴侶蛋白的表達量整體上調，尤其是 HSP90 家族。與正常組織相比，腫瘤組織不僅表達 HSP的量增加，而且 HSP的伴侶功能增強，如高表達的gp96 與突變異常的靶蛋白和多肽分子親合力增加，因而 HSP結合的蛋白或多肽構成了腫瘤特異的抗原指紋，奠定了腫瘤免疫治療的基礎。近年來，隨著免疫學、計算機學和生物信息學的飛速發展，使篩選優勢 CTL 表位肽成為可能。通過鑒定特定腫瘤組織中 HSP結合的多肽抗原指紋圖譜，利用分子模擬技術篩選優勢CTL 表位肽，體外重組多價 HSP-肽復合物抗原腫瘤疫苗，將會給腫瘤的免疫治療帶來新的希望。

[1]Gething MJ, Sambrook J.Protein folding in the cell.Nature, 1992,355(6355):33-45.

[2]Srivastava P.Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity.Nat Rev Immunol, 2002, 2(3):185-194.

[3]Blachere NE, Li Z, Chandawarkar RY, et al.Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity.J Exp Med,1997, 186(8):1315-1322.

[4]Udono H, Levey DL, Srivastava PK.Cellular requirements for tumor-specific immunity elicited by heat shock proteins: tumor rejection antigen gp96 primes CD8+ T cells in vitro.Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91(8):3077-3081.

[5]Srivastava PK, Udono H, Blachere N, et al.Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming.Immunogenetics, 1994, 39(2):93-98.

[6]Srivastava PK.Immunotherapy for human cancer using heat shock protein-peptide complexes.Curr Oncol Rep, 2005, 7(5):104-108.

[7]Singh-Jasuja H, Toes RE, Spee P, et al.Cross-presentation of glycoprotein 96-associated antigens on major histocompatibility complex class I molecules requires receptor-mediated endocytosis.J Exp Med, 2000, 191(11):1965-1974.

[8]Tamura Y, Peng P, Liu K, et al.Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparations.Science,1997, 278(5335):117-120.

[9]Basu S, Srivastava PK.Calreticulin, a peptide-binding chaperone of the endoplasmic reticulum, elicits tumor- and peptide-specific immunity.J Exp Med, 1999, 189(14):797-802.

[10]Elsner L, Muppala V, Gehrmann M, et al.The heat shock protein HSP70 promotes mouse NK cell activity against tumors that express inducible NKG2D ligands.Immunol, 2007, 179(9):5523-5533.

[11]Segal BH, Wang XY, Dennis CG, et al.Heat shock proteins as vaccine adjuvants in infections and cancer.Drug Discov Today, 2006,11(11-12):534-540.

[12]di Pietro A, Tosti G, Ferrucci PF, et al.Heat shock protein peptide complex 96-based vaccines in melanoma: How far we are, how far we can get.Hum Vaccin, 2011, 5(11):727-737.

[13]Eton O, Ross MI, East MJ, et al.Autologous tumor-derived heat-shock protein peptide complex-96 (HSPPC-96) in patients with metastatic melanoma.J Transl Med, 2010, 8:9.

[14]Mazzaferro V, Coppa J, Carrabba MG, et al.Vaccination with autologous tumor-derived heat-shock protein gp96 after liver resection for metastatic colorectal cancer.Clin Cancer Res, 2003, 9(9):3235-3245.

[15]Zhao ZL, Yan L, Cui JD, et al.HSP-peptide complex vaccine in preventing postoperative recurrence of hepatocarcinoma: 32 cases report.Journal of the Fourth Military Medical University, 2005,26(22):2076-2078.(in Chinese)趙子粼, 鄢莉, 崔建東,等.熱休克蛋白抗原肽復合物疫苗預防肝癌術后復發32例.第四軍醫大學學報, 2005, 26(22):2076-2078.

[16]Michaluart P, Abdallah KA, Lima FD, et al.Phase I trial of DNA-hsp65 immunotherapy for advanced squamous cell carcinoma of the head and neck.Cancer Gene Ther, 2008, 15(10):676-684.