油菜遺傳轉化體系研究進展

湯 敏，官春云，劉忠松

(湖南農業大學油料作物研究所，長沙410128)

油菜是重要的油料作物，在20世紀70年代前油菜的遺傳改良都是通過雜交、誘變等傳統育種方法來實現的。隨著生物技術的快速發展，尤其是基因重組和轉基因技術的出現，為油菜的遺傳改良開辟了新的路徑。20余年來油菜轉基因研究得到了迅速發展，但遺傳轉化的效率品種之間差異大［1］，轉化頻率普遍偏低，限制了轉基因技術的普遍利用，影響油菜育種水平的提高和新基因的功能快速分析鑒定。因此，提高轉化效率是油菜轉基因研究的關鍵所在。

迄今為止植物轉基因方法主要分為兩大類，一是農桿菌介導轉化法，二是外源基因直接轉化法。

1 農桿菌介導法

在轉基因方法上，盡管有用PEG法和激光微束法等獲得轉基因植株的報道，但農桿菌介導法仍然是油菜轉基因研究的首選方法。對于油菜來說，子葉柄和下胚軸因其非常易于再生而被視為最理想的轉化受體。其再生方式一般是誘導脫分化產生愈傷組織再分化成芽，主要包括種子萌發，預培養、共培養之后，先誘導愈傷組織，再進行芽的分化和生根培養等步驟。

(1)種子萌發。先將種子用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗 2遍，再用0.1%HgCl2浸泡 15 min，無菌水沖洗5遍，晾干。接種于1/2 MS培養基上，25℃下暗培養4 d，轉光照培養2 d。(2)預培養。用解剖刀切下下胚軸(7～10 mm)，將切下的外植體置于預培養基上預培養2～3 d。(3)共培養。將下胚軸置于農桿菌菌液中浸泡4～5 min，用無菌濾紙吸干外植體表面的菌液，將外植體接種至共培養基上，暗培養2 d。(4)誘導愈傷。將經過共培養的下胚軸平放于不含篩選劑培養基上誘導愈傷及分化，一般培養7～10 d。(5)芽分化。10～15 d左右轉接到相同的含篩選劑的篩選分化培養基中。(6)當分化的不定芽長到2～3 cm時，自芽基部切下轉入生根培養基中誘導生根。

1.1 萌發培養

萌發培養基大多采用全量、半量或1/4 MS培養基，也有采用B5培養基的。佘小玲和李栒［2］以甘藍型油菜雙低品種湘油13號為材料，發現在萌發培養基中加入2 mg/L 6－BA和0.15 mg/L NAA有利于下胚軸形成愈傷組織，從而提高愈傷組織的芽苗分化頻率。而歐陽麗瑩等［3］以4個甘藍型黃籽油菜品種為材料，發現在萌發培養基中添加6－BA和NAA對下胚軸的再生無明顯影響，而來源于含生長調節劑的萌發培養基的下胚軸，其再生苗不僅矮小，而且轉入生根培養基后節間不能伸長。不同品種萌發日齡要求不同。王艷等［4］發現，以5 d苗齡的下胚軸為外植體最有利于芽的分化，其下胚軸再生頻率為35.00%，當苗齡9 d時，再生頻率明顯下降，僅有19.44%。劉曉慶等［5］認為，以6～8 d幼苗的下胚軸為外植體有利于芽的分化，7 d苗齡的甘藍型油菜下胚軸再生頻率可達35.83%，當苗齡為5 d和9 d時，再生頻率分別只有17.65%和19.17%。Cardoza 和 Stewart［6］報道，以8 d 苗齡的下胚軸為外植體進行轉化，轉化頻率可達17% ～25%。筆者試驗發現，芥菜型油菜四川黃籽自交系黑暗培養4 d再光照培養2 d的下胚軸長得綠而壯，有利于后期愈傷組織的形成，且農桿菌浸染后不易褐化。而對于子葉柄則直接光照培養5 d或者先黑暗培養2 d再光照培養3 d，且未長出真葉前有利于分化再生。

1.2 預培養

轉化受體和農桿菌的生理狀態是影響農桿菌介導遺傳轉化的兩個關鍵因素。預培養可以促進細胞分裂，分裂狀態的細胞更容易整合外源DNA，使轉化頻率升高，并能在一定程度上減輕褐化程度［7］。2，4－D對誘導油菜愈傷組織是必需的，且能提高愈傷組織的分化率、質量和時間［8］。Maheshwari等［9］以下胚軸為外植體比較了NAA、IAA、2，4－D和6－BA不同濃度組合對誘導愈傷的影響，結果發現單獨使用2，4－D且濃度為1 mg/L時愈傷率最高為100%。Ali等［10］報道使用0.5 mg/L 2，4 －D 與0.5 mg/L 6－BA組合誘導愈傷率達95% ～96%。預培養時間的長短對細胞正常分化也有很大影響。預培養時間過長，整塊切段形成松散型的愈傷組織，這類愈傷組織轉到分化培養基上大多變褐死亡。Cardoza等［11］在以下胚軸為外植體進行轉化時發現，預培養時間72 h比預培養24 h和48 h的轉化效率高，轉化率達25%。Khan等［12］研究發現預培養72 h農桿菌感染最有效，GUS活性檢測達到80%。Zhang等［13］報道，以下胚軸為外植體，預培養72 h可減輕褐化現象，芽再生頻率可從35.56%提高至57.78%，大大提高轉化效率。

1.3 農桿菌感染濃度和時間

農桿菌感染濃度和時間是影響遺傳轉化的另一個重要因素。菌液濃度過高或偏低，感染時間過長或不足，不是導致受體被農桿菌浸染過度致死，就是受體細胞未被感染。王景雪等［14］發現，以根癌農桿菌LBA4404感染下胚軸，較低的菌液濃度(OD600=0.2～0.4)浸染5 min可以減輕外植體的褐化，有利于外植體的愈傷組織生長和抗性芽苗的分化，當菌液OD600=0.2時，下胚軸抗性苗分化率高達14.44%。張 承 妹［15］等 認 為，以 根 癌 農 桿 菌LBA4404感染子葉柄，菌液濃度以對數分裂中期(OD600=0.7)為佳，此時農桿菌浸染能力最強，外源基因容易整合進去。周小梅等［16］以根癌農桿菌EHA105感染子葉柄時發現，感染時間為10 min時分化率最高，可達到24.3%，感染時間超過15 min時導致褐化，并且時間越長褐化越嚴重，在以后轉入生根培養基時，根不易分化而且常攜帶菌，難以抑制、清除。不同菌株對同一植物的轉化效率存在差異。高武軍等［17］研究發現，胭脂堿型菌株對于油菜的轉化要優于章魚堿型菌株。

1.4 共培養

農桿菌附著后不能立即轉化，只有在創傷部位生存16 h之后的菌體才能誘發腫瘤，這一段時間稱為“細胞調節期”。因此，共培養時間對轉化效率有很大影響，而且不同的物種和受體材料，農桿菌的最佳共培養時間不同。Khan［12］報道，共培養時間為3 d轉化效率最高，共培養時間超過3 d，誘發農桿菌過度生長，外植體將受到過度感染，褐化和軟腐現象嚴重，再生困難，且后繼培養中抑菌困難，轉化率大大降低。Bhuiyan等［18］則發現，共培養時間為2 d轉化效率最好。Zhang［19］研究報道，共培養溫度在25℃時抗性愈傷率最高，采用濾紙共培法即將外植體置于鋪有一張滅菌濾紙的共培養基上培養，可以防止農桿菌因直接接觸培養基引起過度生長、蔓延而造成對外植體的過度浸染，減少褐化。

1.5 脫分化和分化培養基

脫分化和分化培養基一般采用全量MS培養基，并添加6－BA、NAA、抑菌劑、篩選劑和 AgNO3。6－BA對細胞的再分化有決定性作用，對芽的正常發育也有很大影響。在脫分化和分化培養基中，高濃度的6－BA與低濃度的NAA以及適量的AgNO3配合使用，能夠促進油菜子葉和下胚軸的分化出芽。Kamal等［20］報道，在含 3 mg/L ABA、1 mg/L NAA、8 mg/L BAP的培養基中子葉柄的苗再生率可達100%。筆者試驗發現，以芥菜型油菜四川黃籽下胚軸為外植體進行轉化時，分化培養基中一旦添加NAA，下胚軸所形成的愈傷在最初的器官分化中就會產生大量的毛狀根，其芽的再生頻率也顯著下降。

共培養后，外植體表面和內部殘留的農桿菌非常容易引起污染，從而影響不定芽再生。油菜遺傳轉化中一般采用羧芐青霉素和頭孢霉素等抑菌劑來抑制農桿菌的繁殖。有研究認為頭孢霉素能夠增加玻璃化和芽的腐爛壞死，而羧芐青霉素高濃度(500 mg/L)時，不僅可以完全抑制農桿菌的生長，而且可以減少AgNO3的不利作用［21］，有利于芽分化。但羧芐青霉素對生根不利。Khan［12］研究表明，在子葉柄和下胚軸的組織培養中添加AgNO3可明顯提高芽再生頻率，促進芽提早分化，但是濃度超過5 mg/L時容易引起玻璃化苗和組織腐爛壞死。AgNO3使用的最佳時間是共培養后對外植體開始進行選擇時。

1.6 生根培養

生根多采用全量或半量MS培養基，添加或不添加NAA或 IBA。Cardoza等［11］采用1/2MS培養基添加0.5 mg/L IBA，將蔗糖濃度由30 g/L降到10 g/L，一周后便能誘導不定芽生根，且生根率可達100%，而采用MS附加0.1 mg/L IBA的培養基發根遲，且生根率只有25%。但 Maheshwari等［9］發現，采用不添加任何激素的1/2MS培養基培養12～13 d后便可以誘導生根，且生根率可達100%。生根培養基中一般加Kan進行根選，獲得的轉基因植株再進行PCR和大田檢測。

2 浸花轉化方法

浸花法(floral－dip)已成為擬南芥廣泛采用的In Planta轉基因方法，也成功應用于油菜的遺傳轉化中。徐光碩等［22］用根癌農桿菌懸浮液直接浸染油菜花序，比較5個甘藍型油菜供試品種的轉化效率，結果表明無明顯差異，轉化效率達0.1%。付紹紅等［23］運用改進的浸花法將構建的PEPC基因ihpRNA干擾表達載體轉移到甘藍型油菜中，對Westar和F008兩個轉化材料分別處理了20個單株，獲得平均轉化效率為0.69%。

2.1 浸花轉化方法

Bechtold等［24］發明了真空滲入法，將擬南芥即將開花的植株浸入農桿菌菌液，然后用真空泵抽真空再恢復常壓，再置于正常條件下生長，得到大量T－DNA插入突變體。Clough和 Bent［25］在真空滲入法的基礎上又在擬南芥中發展了浸花轉化方法。該法無需進行真空處理，而是在農桿菌浸染液中加入了表面活性物質SilwetL－77，然后浸染擬南芥花序，最后收獲的轉基因種子占所有種子的0.5%。Chung等［26］用農桿菌菌液對擬南芥花序浸染或噴霧，同樣獲得了與真空滲入浸染相當的轉化效率。

Ye等［27］用真空處理花序后按時間順序做了一系列GUS活性的瞬間表達，發現3～5 d后能在花序上觀察到染色，而在植株其他部位很少，5～11 d后能在子房中觀察到染色，染色部位在珠孔區。這說明用浸花法轉化時，外源基因整合的部位是卵細胞。Desfeux［28］采用不同啟動子與GUS基因連接，研究在農桿菌處理后，不同組織部位的染色情況。結果表明，浸花法轉化中直接有效的部位為植物的胚珠，而在浸漬后的花粉中未見任何染色。

和傳統的植物遺傳轉化方法相比，浸花法避免了組織培養階段，排除了組織培養中因體細胞變異導致的目的基因的不正確表達，造成分子遺傳學研究中不利的遺傳背景，是一種避免了植物組織培養的遺傳轉化方法。其突出的優點是操作簡單、快捷，節省時間，在一般實驗室或大田即可進行;轉化率高，易重復;由轉化受體直接可得到種子，長成植株，避開了由體細胞或原生質體培養再生植株的難關以及試管苗移栽不易成活的麻煩。

浸花法只需在油菜盛花期前選擇即將開花的分枝，剪去分枝上已經開放的花。然后將準備好的OD600=0.6～0.8農桿菌菌液離心用MS液重懸，加入5%蔗糖和0.05%的SilwetL－77，將枝條彎曲，使整個花序泡在盛有菌液的燒杯中，上下搖動1 min左右。在確保所有花都已被浸染后，用硫酸鈉紙袋將處理過的花序套住。于終花期將花序上的紙袋取下，管理好植株。待種子成熟時，將處理過的分枝剪下單獨收獲種子，曬干后脫粒儲藏。

2.2 浸花法的影響因素

在擬南芥上的研究表明，浸花法的轉化效率受植株發育時期、滲透劑濃度和滲透介質等多種因素的影響。付紹紅等［29］研究了浸染次數對轉化頻率的影響，采用同一濃度的表面活性劑處理，結果發現6 d內每隔1 d進行連續3次浸漬處理轉化頻率優于1、2次處理。王道杰等［30］以不同遺傳背景的3個甘藍型油菜品種(系)陜3B、L45和Mg23為材料，對真空滲透遺傳轉化方法中真空滲透時間和Silwet L－77濃度與遺傳轉化效果的關系進行了比較，結果表明在0% ～0.05%的濃度范圍內，在相同的真空滲透時間內，隨著Silwet L－77濃度的增加，3個油菜品種的轉化率逐漸升高。當Silwet L－77濃度為0.05%時，10 min的真空滲透時間可獲得最高轉化效率。在浸染液中加入5%蔗糖和10 mg/L的6－BA也可提高轉化效率。

3 存在問題與展望

在農桿菌介導的油菜轉化中，不同基因型品種、不同類型的外植體的分化頻率差異較大，油菜基因轉化頻率低，轉化技術體系重復性差。已經建立的油菜轉化體系主要集中在甘藍型油菜，對于芥菜型油菜的遺傳轉化少有報道，且其轉化率相對于甘藍型油菜的要低。在油菜的遺傳轉化中，外源基因插入植物基因組基本上是隨機的，而且其表達水平、表達部位及表達時間也大多不受控制。獲得的轉基因植物能否保持外源基因的穩定性，即能否穩定地遺傳給下一代，直接關系到基因工程新品種的培育。因此，利用組織化學和分子生物學等多種手段來探索農桿菌與植物細胞互作，以及植物轉化細胞再生的分子機制，以便從根本上提高油菜遺傳轉化率還有待進一步研究。同時，轉基因油菜研究只有與傳統常規育種相結合才能真正實現其社會意義。

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