廣東省耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec分型研究＊

黃 革，蔣文玲，黃愛偉，李運雄

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）自1961年出現以來，迅速在全世界范圍蔓延。感染MRSA不僅治療困難，而且常常引起醫院及社區的感染流行傳播。分子生物學技術對MRSA分型比表型分型具有更好的分辨能力，基因分型是追蹤感染源，明確菌株流行趨勢的有效手段。為此，本研究采取葡萄球菌盒染色體mec（SCCmec）分型方法，對臨床分離的156株MRSA進行基因分型，報道如下。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株 156株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分離自廣東省人民醫院患者各種標本，包括痰液、支氣管沖洗液、鼻拭子、傷口分泌物、膿液、全血、尿液、腹水、引流液、胸腔積液、膽汁、導管物、糞便等。標準菌株：ATCC25923。

1．1．2 主要儀器 PHOENIX－100 微生物自動鑒定系統、VITEK－60微生物自動鑒定系統、PTC200聚合酶鏈反應儀、UVP凝膠成像系統以及Eppendorf核酸測定儀。

1．1．3 試劑 Taq DNA 聚合酶 （MBI Fermentas），dNTP（天象人生物工程公司）、溶葡萄球菌素staphylosin（美國Sigma公司），苯唑西林針劑（中諾藥業有限公司），小量細菌基因組DNA抽提試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，DNA Marker購自北京TIANGEN生物技術有限公司，PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1．2 方法

1．2．1 金黃色葡萄球菌耐甲氧西林表型的檢測采用苯唑西林－鹽瓊脂篩選法。將待測菌0．5麥氏單位菌懸液均勻涂布在含4%NaCl和6μg／mL苯唑西林的MH瓊脂平皿上，同時涂布不含鹽及苯唑西林的MH瓊脂平皿作生長對照。

1．2．2 金黃色葡萄球菌DNA基因組的制備 接種菌株于LB液體培養基，37℃搖床培養18～24h，收集菌株于Eppendorf管，加15μL staphylosin（500μg／mL）和20μL溶菌酶（100mg／mL）于37℃孵育破壁1～2h，隨后用DNA抽提試劑盒抽提。抽提好的DNA在Eppendorf核酸測定儀測定其DNA含量。

1．2．3 SCCmec分型 采用3套多重PCR對MR－SA進行SCCmec分型。第1套多重PCR體系（MPCR1）參考文獻［1－2］，采用多位點復合 PCR 技術的方法，位點選取包括型特異性位點、共同位點、鑒別位點和內參照位點等12個位點。本研究對該多重PCR體系稍作改動，25μL反應體系如下：10×PCR buffer 2．5 μL，2．5mmol／L MgCl2，2．5 mmol／L dNTP，DNA Taq酶1．5U，引物濃度：kdp F1、kdpR1、mecA P4和mecA P7為0．2mmol／L，CIF2F2、CIF2R2、RIF5F10、RIF5R13、SCCmec III J1F 和 SCCmec III J1R 為0．4mmol／L，mecI P2、mecI P3、dcs F2、dcs R1、ccrB2F2、ccrB2R2、ccrC F2和ccrC R2為0．8mmol／L。擴增引物及目標條帶見表1。第2、3套重PCR體系（MPCR2、MPCR3）參考文獻［3］，分別分析 MRSA葡萄球菌盒染色體mec的兩個組成部分ccr基因復合物和mec基因復合物。

表1 MPCR1引物序列及目標條帶Tab．1 Primers used in MPCR1

1．2．4 擴增條帶測序 MPCR1產物包括495bp條帶、449bp條帶、414bp條帶、342bp條帶、311 bp條帶、284bp條帶、243bp條帶、209bp條帶、381bp條帶、303bp條帶和162bp條帶均送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

2 結 果

2．1 156株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌主要分離自呼吸道標本，痰液、支氣管沖洗液和鼻拭子標本118份，占75．6%。分泌物標本12份，占7．7%，血標本7份，占4．5%，其他標本包括膿液、尿液、腹水、引流液、胸腔積液、膽汁、引流管等19份，占12．2%。

2．2 根據MPCR1擴增結果，156株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中，6株MRSA不能分型，可分型率為96．2%。可分型的150株 MRSA利用多重PCR可以擴增出3～6條特異條帶，依據條帶的不同，可將SCCmec分為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ型。各型SCCmec PCR擴增特點見圖1。

圖1 MRSA各型SCCmec MPCR1擴增電泳結果1、2泳道：Ⅱ型SCCmec；3、4泳道：Ⅳ型SCCmec；5、6、7、8泳道：Ⅲ型SCCmec；9、10泳道：Ⅴ型SCCmec；M：Marker IFig．1 SSCmectyping result with MPCR1strategy1，2：SSCmecⅡ；3，4：SSCmecⅣ；5．6，7，8：SCCmecⅢ；9，10：SCCmecⅤ；M：DNA molecular size marker（Marker I：TIANGEN BIOTECH （BEIJING）CO．，LTD）

2．3 送上海生工生物工程技術服務有限公司測序的擴增產物495bp條帶、449bp條帶、414bp條帶、342bp條帶、311bp條帶、284bp條帶、243bp條帶、209bp條帶、381bp條帶、303bp條帶和162bp條帶等11個序列利用GenBank進行blast，均為PCR擴增目標片段。

2．4 分析mec基因復合物特點 針對mec基因復合物特點設計的MPCR2體系將150株MRSA的mec基因復合物分為A、B及C3類，不能分型的6株MRSA與MPCR1不能分型的菌株完全重疊。3種mec類型的PCR擴增片段見圖2。

圖2 A、B、C 3類mec基因復合物PCR電泳結果泳道1：A－mec；泳道2：B－mec；泳道3：C－mec；M：Marker IIIFig．2 Amplification of the mec gene complex with MPCR2strategy1：class A mec；2：class B mec；3：class C mec；M：DNA molecular size marker （MarkerⅢ：TIANGEN BIOTECH （BEIJING）CO．，LTD）

2．5 分析ccr基因復合物特點 針對ccr基因復合物特點設計的MPCR3體系可將MRSA分為ccrA1－ccrB、ccrA2－ccrB、ccrA3－ccrB、ccrA4－ccrB4和ccrC5型。本研究分離的156株MRSA可擴增到ccrA2－ccrB、ccrA3－ccrB 及ccrC 3 型，未 發 現ccrA1－ccrB 和 ccrA4－ccrB 2 型，ccrA2－ccrB、ccrA3－ccrB及ccrC 3種類型的PCR擴增片段見圖3。

圖3 不同型別ccr基因復合物PCR電泳結果泳道 1：ccrC；泳 道 2：ccrC ＋ccrA3－ccrB；泳 道 3：ccrA2－ccrB；M：D2000Fig．3 Amplification of the type of ccr gene complex withMPCR3strategy1：type ccrC；2：type ccrCand type ccrA3－ccrB；3：type ccrA2－ccrB；M：DNA molecular size marker（D2000：TIANGEN BIOTECH （BEIJING）CO．，LTD）

2．6 在本地區分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌以Ⅲ型SCCmec最為多見，占83．3%（125／150），其次為ⅡSCCmec型，占7．3%（11／150），Ⅳ、Ⅴ型SCCmec均占4．7%（7／150）。其中，Ⅲ型 SCCmec根據擴增片段的差異可分為4個亞型，Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型SCCmec則均有2個亞型。詳見表2。

表2 MRSA的SCCmec類型分布Tab．2 SCCmectypes identified in 150MRSA strains by PCR

3 討 論

葡萄球菌盒染色體mec（SCCmec）是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的定義特征，它是一種攜帶mecA基因的新型移動基因元件，能作為載體在葡萄球菌屬中交換耐藥基因信息。SCCmec可自發剔除、重組的特性，使它成為了耐藥基因傳遞的運載工具和儲存池，是葡萄球菌耐藥性產生、耐藥譜擴大的根本原因［4］。SCCmec主要由攜帶mecA 基因的mec基因復合體、編碼位點特異性重組酶的ccr基因復合物以及mec基因復合體與ccr基因復合物之外的可變區域——J區域構成［5］。在不同的 MRSA菌株中，因SCCmec所攜帶外來基因的數量、位置以及內在固有基因結構因外來基因的插入，造成部分或全部刪切、缺失，因此，mec基因復合體、ccr基因復合物和J區域存在結構差異性，而這結構差異性正是SCCmec分型的分子基礎。到目前為止，在MRSA中，已報道攜帶Ⅰ～Ⅷ八種類型的SCCmec，其中，醫院獲得性 MRSA主要攜帶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型SCCmec［4］。本研究分離的156株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中，150株可分為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型SCCmec，不能分型的6株MRSA僅擴增到ccrC基因。不能分型的6株MRSA利用MPCR1及MPCR2體系擴增均沒有擴增到任何目標條帶，推測菌株發生變異或是新類型SCCmec，有待進一步研究證實。

不同國家、地區，SCCmec流行類型不同。與日本、韓國流行Ⅱ型SCCmec MRSA不同［6］，本地區流行Ⅲ型SCCmec MRSA，83．3%（125／150）菌株攜帶Ⅲ型SCCmec，其次為Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型SCCmec。利用MPCR1體系，125株Ⅲ型SCCmec MRSA可分為4個亞型，其中，經典的Ⅲ型SCCmec 4株，經典的ⅢA型SCCmec 28株，與經典ⅢA型SCCmec相比較多了342bp條帶的菌株38株，缺少243bp條帶菌株55株。342bp條帶由位于mecA下游的下游恒定序列（down constant sequence，dcs）所編碼，是Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型SCCmec所特有。此外，本研究發現，除2株Ⅱ型SCCmec MRSA和2株Ⅴ型SCCmec MRSA外，其余菌株較經典的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型SCCmec均多攜帶495bp條帶。編碼495bp產物的基因位于mecA上游，是胞漿素敏感表面蛋白（plasmin－sensitive surface protein，pls）基因的部分序列，作為pls的指示位點，為Ⅰ型SCCmec特異性位點。而Ⅰ型SCCmec特有的pls位點和Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型SCCmec所特有的dcs位點出現在Ⅲ型SCCmec在國內外亦有報道［6－7］。但缺少243bp條帶Ⅲ型SCCmec則未見報道。

實驗結果顯示，ccrC并不局限于Ⅴ型SCCmec菌株，在125株Ⅲ型SCCmec均擴增出ccrC基因和449bp條帶。正如Chongtrakool［6］研究發現，Ⅲ型SCCmec實際攜帶兩類SCCmec元件，分別為Ⅲ型SCCmec和SCCmercury元件，而SCCmercury元件攜帶了ccrC基因復合物。

國內的多個研究亦證實［8－9］，我國分離的 MRSA以Ⅲ型SCCmec MRSA為主。分析其原因，一是研究的MRSA菌株主要來自醫院感染，社區獲得性MRSA較少，因此Ⅳ、Ⅴ型SCCmec少見；二是國內存在較為嚴重的濫用抗菌藥物現象，導致攜帶最多耐藥基因的Ⅲ型SCCmec MRSA呈優勢流行。因此，合理使用抗生素在我國顯得尤為重要。

［1］Oliveira DC，de Lencastre H．Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin－resistant Staphylococcus aureus［J］．Antimicrob A－gents Chemother，2002，46（7）：2155－2161．DOI：10．1128／AAC．46．7．2155－2161．2002

［2］Milheiric C，Oliveira DC，de Lencastre H．Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus［J］．Antimicrob Agents Chemother，2007，51（9）：3374－3377．DOI：10．1128／AAC．00275－07

［3］Kondo Y，Ito T，Ma XX，et al．Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment：rapid identification system for mec，ccr，and major differences in junkyard regions［J］．Antimicrob Agents Chemother，2007，51（1）：264－274．DOI：10．1128／AAC．00165－06

［4］IWG－SCC．Classification of staphylococcal cassette chromosome mec（SCCmec）：Guidelines for reporting novel SCCmec elements［J］．Antimicrob Agents Chemother，2009，53（12）：4961－4967．DOI：10．1128／AAC．00579－09

［5］Xu ZB，Shi L．Vehicle for gene exchange among staphylococcal species－SCCmec［J］．Chin J Antibiotics，2007，32（8）：449－453．（in Chinese）徐振波，石磊．葡萄球菌屬中交換基因的載體——SCCmec［J］．中國抗生素雜志，2007，32（8）：449－453．

［6］Chongtrakool P，Ito T，Ma XX，et al．Staphylococcal cassette chromosome mec （SCCmec）typing of methicillin－resistant Staphylococcus aureus strains isolated in 11Asian countries：a proposal for a new nomenclature for SCCmec elements［J］．Antimicrob Agents Chemother，2006，50（3）：1001－1012．DOI：10．1128／AAC．50．3．1001－1012．2006

［7］Ma YH，Lv X，Qi W，et al．Genotyping of staphylococcal cassette chromosome mec and antimicrobial resistance of 79methicillin－resistant Staphylococcus aureus［J］．Tianjin Med J，2010，38（6）：452－454．（in Chinese）馬艷紅，呂星，祁偉，等．79株臨床分離MRSA的SCCmec基因分型及耐藥性分析［J］．天津醫藥，2010，38（6）：452－454．

［8］Ye H，Gao YY，Lv XJ，et al．Staphylococcal cassette chromosome mec types in methicillin－resistant Staphylococcus aureus［J］．Med J West China，2009，21（4）：527－529．（in Chinese）葉慧，高燕渝，呂曉菊，等．耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec分型研究［J］．西部醫學，2009，21（4）：527－529．

［9］Ouyang FX，Bu PF，Huang HQ，et al．Seven kinds of new SCCmec type in methicillin－resistant Staphylococcus aureus and their susceptibility to the antibiotics［J］．Acta Microbiologica Sinica，2007，47（2）：201－207．（in Chinese）歐陽范獻，卜平鳳，黃惠琴，等．MRSA的7種新SCCmec型別及其抗藥特性［J］．微生物學報，2007，47（2）：201－207．