miR－145抑制VSMC增殖的作用及其相關信號通路研究

王澤慧，邊云飛，肖傳實

血管平滑肌細胞（VSMC）的異常增殖是高血壓血管重構以及血管增殖性疾病，如動脈粥樣硬化、經皮腔冠狀動脈介入治療術（PCI）后再狹窄、血管移植術后新生內膜增生等發生發展的主要病理基礎。

microRNA可以調節多種基因的表達。近年來發現miR－145是正常動脈中含量最豐富的miRNA，且主要聚集在VSMC［1］。miR－145在原代培養的VSMC中含量最豐富而在去分化的VSMC中的表達是下調的［2］。本實驗室前期已經成功構建了大鼠miR－145重組慢病毒載體并在去分化型VSMC中過表達，但是miR－145是否能抑制去分化型VSMC增殖及其機制仍不清楚。故本實驗以體外培養的大鼠原代VSMC為模型，應用PDGF－BB作為外界刺激因子誘導VSMC增殖，同時用構建好的大鼠miR－145重組慢病毒載體浸染目的細胞，CCK－8法檢測細胞增殖情況，并在分子水平探討miR－145是否通過抑制PDGF激活MAPK途徑從而抑制VSMC增殖，從而為其抑制VSMC增殖的作用機制提供新的思路及實驗依據。

1 材料與方法

1．1 材料 山西醫科大學實驗動物中心提供健康SD大鼠，體重110g～130g；DMEM細胞培養基、胎牛血清購自Hyclone公司；PDGF－BB購自美國PEPROTECH公司；CCK－8試劑購自碧云天公司；TRIzol、逆轉錄試劑盒、RT－PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；引物設計與合成由上海吉瑪公司完成；蛋白提取試劑盒購自北京普利萊公司；PVDF膜購自北京索萊寶公司；磷酸化ERK1／2和總ERK1／2抗體購自北京博奧森公司；磷酸化JNK和總JNK抗體、磷酸化p38MAPK和總p38MAPK抗體均購自美國Cell signaling technology公司；羊抗兔二抗購自Santa公司；marker購自富酶泰斯生物技術（深圳）有限公司；Ecl－plus發光試劑盒購自武漢博士德公司；其他試劑均系進口或國產分析純。

1．2 方法

1．2．1 大鼠原代VSMC培養 采用組織塊貼壁法培養VSMC，傳代后對VSMC進行抗αSM－actin免疫細胞化學染色鑒定。選擇3～8代進行實驗。

1．2．2 實驗分組 將細胞分為4組。空白對照組：培養的大鼠原代VSMC不做任何處理。PDGF－BB組：大鼠原代VSMC中加 入 終 濃 度 為 10g／mLPDGF－BB。PDGF－BB＋ miR－145組：細胞轉染miR－1 4 5慢病毒載體7 2h后加入終濃度為1 0 g／mLDGF－BB。miR－NC組：細胞轉染陰性慢病毒載體。

1．2．3 CCK－8法測細胞增殖 收集對數期細胞種96孔板，每孔加入100μL細胞，邊緣孔用無菌PBS填充，加入各組中的藥物及慢病毒，每孔100μL，每組設5個復孔。5%CO2，37℃孵育48h。每孔加入10μLCCK－8溶液繼續培養1h～4h。酶標儀在450nm波長處測每孔的光密度值。

1．2．4 細胞RNA提取和RT－PCR反應 使用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄反應得到對應細胞的cDNA模板，采用SYBR Green法進行Real－time PCR檢測，反應體系為20 μL，包含上下游引物、DNA 模板、Taq DNA polymerase和ddH2O。定量反應條件：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火31s，進行40個循環。各組PCR均重復3次。使用凝膠成像系統分析結果。mRNA的相對表達量用2－△△Ct方法來表示，其中△Ct＝Ct目標mRNA－CtGAPDH，△△Ct＝△Ct處理－△Ct對照。

1．2．5 Western印跡方法檢測 ERK1／2 和 p－ERK1／2等的表達 用Bradford法測蛋白濃度。5%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，轉移至硝酸纖維膜（PVDF膜），依次加入兔抗鼠ERK1／2和p－ERK1／2抗體（1∶2 00）、兔抗鼠JNK和p－JNK抗體（1∶2 000）、兔抗鼠p38MAPK和p－p38MAPK（1∶2 000）浸泡濾膜，4℃過夜，洗滌后加入堿磷酶標記的羊抗兔IgG（1∶3 000），洗膜后ECL化學發光試劑檢測。定量分析采用分子生物學圖像分析系統。

1．3 統計學處理 采用SPSS13．0軟件，用均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。

2 結 果

2．1 miR－145對PDGF誘導VSMC增殖的影響 CCK－8結果顯示，與空白對照組比較，miR－NC組OD值無統計學意義；PDGF組OD值明顯升高（P＜0．05），PDGF可促進VSMC增殖。與PDGF－BB組比較，PDGF－BB＋miR－145組OD值明顯下降（P＜0．05），提示miR－145可抑制PDGF誘導的VSMC增殖。詳見表1。

表1 miR－145對VSMC增殖影響的CCK－8結果（±s）

表1 miR－145對VSMC增殖影響的CCK－8結果（±s）

組別 CCK－8（OD）空白組0．855±0．062 miR－NC組 0．777±0．058 PDGF－BB＋miR－145組 0．545±0．0351）PDGF－BB組 1．374±0．0861）2）與空白組比較，1）P＜0．05；與PDGF－BB＋miR－145組相比，2）P＜0．05

2．2 miR－145對VSMC相關基因的影響 RT－PCR結果顯示：與空白對照組比較，miR－NC組PCNA、c－Jun及SM22amRNA的表達無統計學意義，PDGF組PCNA、c－Jun mRNA的表達分別上調1．37倍和2．68倍（P＜0．05），而SM22amRNA的表達下調80%（P＜0．05）。提示PDGF可促進 VSMC增殖抑制VSMC分化；與 PDGF－BB組比較，PDGF－BB＋miR－145組 PCNA、c－Jun mRNA 的表達分別下調66．4%和77．2%（P＜0．05），而SM22amRNA 的表達上調4．4倍（P＜0．05）。提示miR－145可抑制PDGF誘導的VSMC增殖而促進VSMC分化。

2．3 miR－145對PDGF誘導的p－ERK／ERK 蛋白表達的影響

Western－blot結果顯示：PDGF－BB（10ng／mL）誘導 VSMC后，p－ERK水平明顯上調，與對照組相比有統計學意義（P＜0．05）。轉染 miR－145干預72h后再加入 PDGF－BB刺激，p－ERK水平明顯下調，與PDGF組相比差異有統計學意義（P＜0．05）。空質粒組與對照組相比無統計學意義。詳見圖1。

圖1 miR－145對PDGF誘導的p－ERK／ERK蛋白表達的影響

2．4 miR－145對PDGF誘導的p－JNK／JNK蛋白表達的影響Western－blot結果顯示：PDGF－BB（10ng／mL）誘導 VSMC后，p－JNK水平明顯上調，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0．05）。轉染 miR－145干預72h后再加入PDGF－BB刺激，p－JNK 水平明顯下調，與PDGF組相比差異有統計學意義（P＜0．05）。空質粒組與對照組相比無統計學意義。詳見圖2。

圖2 miR－145對PDGF誘導的p－JNK／JNK蛋白表達的影響

2．5 miR－145對 PDGF 誘導的 p－p38MAPK／p38MAPK 蛋白 表 達 的 影 響 Western－blot結 果 顯 示 ：PDGF－BB（1 0 ng／mL）誘導VSMC后，p－p38MAPK水平明顯上調，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0．05）。轉染miR－145干預72h后再加入PDGF－BB刺激，p－p38MAPK水平明顯下調，與PDGF組相比差異有統計學意義（P＜0．05）。空質粒組與對照組相比無統計學意義。詳見圖3。

圖3 miR－145對PDGF誘導的p－p38MAPK／p38MAPK蛋白表達的影響

3 討 論

VSMC由分化表型向去分化表型轉化是VSMC增殖與遷移的關鍵性起始步驟，這是許多血管增生性疾病如：動脈粥樣硬化、高血壓和經皮冠狀動脈介入治療（PCI）術后再狹窄等疾病共同的細胞病理基礎之一。microRNA是近些年來研究的熱點之一，而miR－145受到關注是由于它在許多癌癥中的表達下調，能夠抑制癌細胞增殖，是一種新發現的抑癌基因［3，4］。然而，miR－145能否抑制VSMC的增殖仍不清楚。miR－145是VSMC一個重要的表性標記物和表型調節劑，能夠抑制新生內膜的形成［1］。但是抑制新生內膜形成的具體機制尚未闡明。因此，進一步研究miR－145抑制VSMC增殖的機制是本次研究的重點。

細胞增殖是一系列基因有序調控的結果，在許多病理情況下，外界環境造成某些生長因子（如PDGF）增多，通過刺激信號轉導網絡調節某些基因表達增多，使VSMC的增殖失控，引起一系列病理改變［5］。MAPK是刺激脊柱類動物細胞增殖、分化的信號在細胞內傳遞的交匯點或共同通路［6，7］。PDGF能夠吸引血管中層平滑肌向內膜下遷移，使VSMC從收縮型變為合成型，合成型（即去分化型）VSMC有很強的增殖能力及更高的MAPK水平［8］。PDGF通過受體酪氨酸酶途徑激活靜止期VSMC的 MAPK［9］，MAPK 激活轉錄因子，增加 VSMC的DNA合成，促進細胞增殖［10］。miR－145能否通過抑制去分化型VSMC中的MAPK信號通路，進而抑制VSMC的增殖尚不清楚。本實驗測CCK－8比較PDGF組和轉染miR－145慢病毒載體再給PDGF組的VSMC增殖情況；RT－PCR說明miR－145抑制增殖的機制與VSMC相關基因的表達有關；同時做western blot說明miR－145抑制PDGF誘導的VSMC增殖的機制與其抑制MAPK通路中的p－ERK／ERK、p－JNK／JNK、p－p38MAPK／p38MAPK蛋白的表達有關。

［1］Cheng Y，Liu X，Yang J，et al．MicroRNA－145，a novel smooth muscle cell phenotypic marker and modulator，controls vascular neointimal lesion formation［J］．Circ Res，2009，105（2）：158－166．

［2］Zhang Chunxiang．microRNA－145in vascular smooth muscle cell biology a new therapeutic target for vascular disease［J］．Cell Cycle，2009，8（21）：3469－3473．

［3］Liu X，Sempere LF，Galimberti F，et al．Uncovering growth suppressive microRNAs in lung cancer［J］．Clin Cancer Res，2009，15：1177－1183．

［4］Cho WC，Chow AS，Au JS．Restoration of tumour suppressor hsamiR－145inhibits cancer cell growth in lung adenocarcinoma patients with epidermal growth factor receptor mutation［J］．Eur J Cancer，2009，45：2197－2206．

［5］秦旭平，廖端芳，李元建．血管平滑肌細胞增殖及其調控［J］．中國動脈硬化雜志，2001，9（5）：450－454．

［6］王智昊，吳揚，王英凱．血管平滑肌細胞的增殖因素及機制［J］．吉林大學學報（醫學版），2011，5（37）：561－566．

［7］Berk BC，Corson MA．AngiotensinⅡsignal transduction in vascular smooth muscle［J］．Circ Res，1997，80：607．

［8］Li X．Vascular smooth muscle cells grown on Matrigel．A model of the contractile phenotype with decreased activation of mitogen－activated protein kinase［J］．J Biol Chem，1994，269：19653－19658．

［9］Langan，EM．Regulation of MAP kinase activity by growth stimuli in vascular smooth muscle［J］．J Surg Res，57，215－220．

［10］尹小龍，呂俊升．絲裂原激活蛋白激酶與血管平滑肌細胞增殖的信號轉導［J］．國外醫學：生理、病理科學與臨床分冊，1997，17（2）：113－115．