阿魏酸鈉對老年大鼠學習記憶能力改善作用及機制

李世章，金 英，楊 成，隋海娟

(遼寧醫學院藥理學教研室，遼寧錦州 121001)

阿爾采末病(AD)是一種慢性原發、進行性腦變性病，病因復雜，發病機制尚不清楚，但有研究表明，AD患者認知功能下降與突觸素(SYP)的丟失存在相關性。另有研究表明，神經生長因子(NGF)可促進海馬內突觸的重建來提高SYP的表達從而改善AD大鼠的學習記憶能力［1］。NGF必須與其特異性高親和力受體酪氨酸激酶受體A(TrkA)結合才能發揮作用，當TrkA受體的膜外部位點與NGF結合后形成TrkA二聚體，自身膜內部酪氨酸殘基磷酸化，通過PI3K-Akt途徑，最終啟動即早基因和延遲反應基因的轉錄［2］。

阿魏酸是傳統中藥當歸和川芎的有效單體成分，具有抗氧化、抗自由基、抗感染及拮抗NO生成等藥理作用。最近研究發現，阿魏酸納(sodium ferulate，SF)可減輕大鼠海馬錐體神經元的損傷，對抗淀粉樣 β-蛋白引起的大鼠的學習記憶障礙［3］。本實驗通過觀察阿魏酸鈉對海馬區SYP、TrkA、磷酸化PDK1、磷酸化Akt蛋白表達的影響，以探討該藥改善老年大鼠學習記憶能力的作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及給藥方法 Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂，老年大鼠(500～600 g，18月)45只，隨機分為3組:生理鹽水對照組(每天灌胃給等量生理鹽水);SF 100、200 mg·kg－1劑量組(SF用生理鹽水溶解，灌胃量均為1.0 ml，現配現用);青年大鼠(250～350 g，3月)對照組15只(每天灌胃給等量生理鹽水)。灌胃時間均為2月。

1.2 Morris水迷宮實驗 參照Morris［4］方法實驗，記錄大鼠尋找平臺并爬上平臺所需的時間(逃避潛伏期)和計算大鼠在原平臺象限游泳時間占總游泳時間的百分比，以觀察大鼠的學習記憶能力的改變。

1.3 免疫組織化學染色 Morris水迷宮實驗結束后，用10%水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉大鼠，經頸總動脈持續灌注生理鹽水50 ml，然后再灌注4%多聚甲醛50 ml，取腦組織進行石蠟包埋，連續進行冠狀切片(厚度為5 μm)，每4張取1張，進行免疫組織化學染色觀察海馬SYP及TrkA表達的改變。免疫組織化學染色操作步驟SABC免疫組化染色試劑盒操作說明進行。

1.4 Western blot檢測SYP、磷酸化PDK1、磷酸化 Akt蛋白表達水平 取大鼠海馬的CA3區，提取總蛋白，用10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質，轉膜，分別加一抗(一抗為1∶1 000稀釋)4℃過夜，二抗(1∶1 000稀釋)，放置化學發光凝膠系統分析儀中進行ECl化學發光，測定SYP、p-PDK1、p-Akt473。每個抗體測定時都進行β-肌動蛋白測定，以保證蛋白上樣量的一致性，利用Visionworks 6.3.3圖像采集及分析軟件對蛋白帶進行分析，實驗重復3次。

2 結果

2.1 SF對老年大鼠空間學習記憶的影響 灌胃給藥2月后，SF 100、200 mg·kg－1組老年大鼠的空間學習記憶能力明顯改善，表現為逃避潛伏期較對照組的老年大鼠明顯縮短，在原平臺象限游泳時間占總時間百分比明顯升高。

2.2 SF對老年大鼠海馬SYP蛋白表達的影響 老年對照組大鼠海馬CA1區、CA3區及齒狀回(DG)區SYP表達很少，應用SF 200 mg·kg－1的老年大鼠海馬CA1區、CA3區及DG區SYP表達均明顯增加，但CA3增加最明顯。SYP免疫反應產物為棕黃色點片狀或顆粒狀，分布密集，主要分布在神經氈內，有些顆粒圍繞在神經元周圍。

正常老年組大鼠海馬CA3區SYP的表達水平明顯降低。給予SF(100，200 mg·kg－1)可使老年大鼠海馬CA3區SYP的表達水平明顯增加。

2.3 SF對老年大鼠海馬神經元TrkA表達水平的影響老年對照組海馬CA1區、CA3區及DG區TrkA表達陽性的細胞數較少，SF 200 mg·kg－1組海馬CA1區、CA3區及DG區TrkA陽性細胞數表達明顯增加，著色加深，組織細胞結構呈棕黃色聚集。

2.4 SF對老年大鼠海馬CA3區p-PDK1及p-Akt表達的影響 正常老年大鼠海馬CA3區p-PDK1及p-Akt表達水平較青年對照組明顯降低，SF(100、200 mg·kg－1)組能明顯增加p-PDK1及p-Akt的蛋白表達水平。

3 討論

本實驗觀察了阿魏酸鈉對老年大鼠學習記憶能力的改善作用及機制，研究結果顯示SF可使老年大鼠海馬SYP及TrkA表達明顯增加，海馬CA3區p-PDK1和p-Akt的表達水平明顯增加。這些結果表明SF能夠改善老年大鼠學習記憶能力，其作用機制可能與上調SYP、TrkA、p-PDK1和p-Akt的表達有關。

［1］ 洪樂鵬，龍大宏，冷水龍.Neurturin和NGF促進AD鼠學習記憶恢復及海馬突觸素表達［J］.中國行為醫學科學，2004，13(2):134－5.

［1］ Hong L P，Long D H，Leng S L.Neurturin and NGF improve the ability of learning and memory and expression of synaptophysin in hippocampus of rats with fimbria-fornix transection［J］.Chin J Behavioral Med Sci，2004，13(2):134 －5.

［2］ 鄭麗君，楊 杰.TrkA受體信號轉導途徑及在腦缺血損害中的研究進展［J］.中風與神經疾病雜志，2008，25(4):501 －3.

［2］ Zheng L J，Yang J.The research of TrkA receptor signal transduction pathway in ischemic brain damage［J］.J Apopl Nerv Dis，2008，25(4):501 －3.

［3］ 金 英，閆恩志，范 瑩，等.阿魏酸鈉對抗Aβ25-35致大鼠學習記憶障礙與IL-1β和p38MAPK表達的相關性探討［J］.中國藥理學通報，2006，22(5):602 －6.

［3］ Jin Y，Yan E Z，Fan Y，et al.Effects of sodium ferulate on Aβ25-35-induced cognitive deficits and expression of IL-1β and p38MAPK in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(5):602 －6.

［4］ Morris R.Development of a water maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.J Neurosci Methods，1984，11(1):47－ 60.