星點設計-效應面法優選丹參中丹參總酚酸的提取工藝

盧君蓉，傅超美，劉芳，章津銘，林俊芝，胡慧玲

(成都中醫藥大學藥學院中藥材標準化教育部重點實驗室、中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137)

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，味苦、性微寒。歸心、肝經，為常用川產道地藥材之一，具有活血化瘀、涼血消癰的功效［1］。所含丹參總酚酸為其主要的水溶性有效成分，主要含有丹酚酸B、迷迭香酸等;丹參總酚酸提取物被收載于《中國藥典》2010年版一部植物油脂和提取物項下［2］。星點設計(CCD)為國內外近年來常用于優化藥材和制劑提取工藝、處方篩選的方法，該方法簡便、直觀，且在模型建立上采用非線性數學模型擬合，復合相關系數較高，預測值更接近真實值［3-9］。本試驗中引入星點實驗設計結合效應面法優選丹參中丹參總酚酸的提取工藝。

1 儀器與試藥

LC—10AT高效液相色譜儀(日本島津株式會社);UV—1100紫外—分光光度計(上海天美科學儀器公司);BP211D電子分析天平(十萬分之一，德國Sartorius公司);BP121S電子分析天平(萬分之一，德國Sartorius公司);202-2型干燥箱(上海市實驗儀器總廠)。

丹參藥材購于成都荷花池中藥材專業市場，經成都中醫藥大學中藥標本館盧先明教授鑒定為丹參Salvia miltiorrhizaBge.的根及根莖。丹酚酸B對照品(成都曼斯特生物制品公司，批號A0056，純度≥98%)，乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

試驗中參照《中國藥典》2010年版一部丹參藥材項下定量測定方法［2］和文獻方法［10］對各樣品中丹酚酸B和丹參總酚酸的含有量進行測定。

2.1 丹酚酸B測定［2］

2.1.1 色譜條件Diamonsil鉆石ODS-C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫25℃;流動相為甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)，體積流量1 mL/min;檢測波長286 nm;進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加75%甲醇定容至10 mL棕色量瓶中，用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜濾過，得質量濃度為0.146 mg/mL的丹酚酸B對照品溶液，備用。

2.1.3 樣品溶液的制備取丹參粉末(過三號篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 標準曲線的繪制取2.1.2項下丹酚酸B對照品溶液10、12、14、16、18 μL，分別注入高效液相色譜儀，以峰面積(Y)為縱坐標，丹酚酸B的進樣量為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=1×106X－225 177(r=0.999 9)，進樣量在1.47～2.94 μg范圍內，線性范圍良好。2.1.5藥材定量測定取已制備好的丹參樣品溶液，共3份，每份進樣10 μL，計算丹參樣品中丹酚酸B的含有量，得到丹參樣品中丹酚酸B的平均質量分數為6.62%，高于2010年版《中國藥典》一部丹參項下含丹酚酸B(C36H30O16)不得少于3.0%的規定，為合格藥材。

2.2 丹參總酚酸定量測定［10］

2.2.1 對照品溶液的制備取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加蒸餾水定容至10 mL棕色量瓶中，用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜濾過，得質量濃度為0.146 mg/mL的丹酚酸B對照品溶液，分別從其中精密移取0、0.3、0.6、1.3、2.5、5 mL加水定容至10 mL，精密移取稀釋液2 mL，分別依次加入0.5%的NaNO25 mL、10%的Al(NO3)30.5 mL、1 mol/L的NaOH 5 mL，靜置顯色后，備用。

2.2.2 樣品溶液的制備取各試驗安排下的提取液續濾液1 mL，加水定容至25 mL，再精密吸取1 mL溶液，定容至10 mL，精密移取稀釋液2 mL，按2.2.1項下顯色方法顯色，即得。

2.2.3 標準曲線的繪制以空白顯色溶液為對照，取2.2.1項下丹酚酸B對照品溶液，分別在499 nm條件下測定其吸光度，以其吸光度為縱坐標，質量濃度為橫坐標作圖，得到標準曲線方程為:Y=4.467 7×X－0.002 3(r=0.999)，質量濃度在0.001～0.01 mg/mL范圍內，線性范圍良好。

2.3 星點設計試驗丹參酚酸類為水溶性成分，且受熱易分解，預試驗對超聲法、回流法、溫浸法3種方法進行比較，以溫浸法較好，故以溶媒用量、提取溫度、提取時間為考察因素，提取次數為非連續變量，回歸處理較困難，結合預試驗結果和工業生產的實際，設定提取次數為2次，其余因素的水平據試驗結果而定。影響因素及水平見表1，分別取50 g丹參藥材粉末，以丹酚酸B含有量、丹參總酚酸含有量、干膏量三者的加權評分值為指標，按表2中試驗安排進行試驗。

表1 影響因素及水平

2.4 模型擬合用Design Expert 7.0統計軟件，以丹酚酸B含有量、丹參總酚酸含有量、干膏量三者的總體歸一值為指標對各因素進行多元線性回歸和二項式方程擬合。

所得多元線性回歸方程:Y=0.64+0.14X1－0.075X2－0.039X3(F=16.93，r=0.872 1，P＜0.001);

擬合所得二項式方程:Y=－3.594 97+0.286 16×A+0.062 018×B+0.012 321×C－2.580 44×10－3×A×B－3.684 45×10－4×A×C－2.629 61×10－4×B×C+1.484 3×10－3×A2－1.322 6×10－4×B2+4.378 72×C2×10－5(F=8.07，r=0.937 5，P＜0.001 5)。采用相關系數對兩種擬合方式進行比較可知，采用二項式方程擬合較好，可信度較大，對結果的模擬優化效果較好。

2.5 工藝優化與估測因變量曲面圖是三維圖，只能表達兩個自變量的函數，因此固定三個自變量之一為中值，以擬合的目標函數為數學模型，應用Design Expert 7.0統計軟件繪制因變量三維圖及等高圖。見圖1～3。

由溶媒用量與溫浸溫度兩因素作圖可知，在溶媒用量為10.5～12.0倍、溫浸溫度為60～75℃范圍內，提取的總體歸一值最高;由溶媒用量與溫浸時間兩因素作圖可知，當溶媒用量在10.5～12.0倍、溫浸時間在105～150 min范圍內，提取的總體歸一值最高;由溫浸溫度與溫浸時間作圖可知，當溫浸溫度在65～67.5℃、溫浸時間在127.5～150 min范圍，提取的總體歸一值值最高。綜合以上信息，可得選取的最佳范圍為溶媒用量為10.5～12.0倍、溫浸溫度為65～67.5℃、溫浸時間為127.5～150 min。

考慮到工業生產中關心投入產出比和成本問題，以及預試驗的結果，故將本試驗優選的丹參總酚酸提取的最佳工藝為丹參藥材粉末(過一號篩)，加入11倍量水，在65℃下提取2次，每次130 min。

表2 星點設計及結果

圖1 溶媒用量與溫浸溫度對OD影響的三維圖和等高圖

圖2 溶媒用量與溫浸時間對OD影響的三維圖和等高圖

2.6 驗證試驗對以上所得工藝進行驗證，見表3。

圖3 溫浸溫度與溫浸時間對OD影響的三維圖和等高圖

表3 驗證試驗(n=3)

3 討論

3.1 丹參為常用川產道地中藥材之一，在本試驗中以丹酚酸B含有量、丹參總酚酸含有量及干膏量三者的總體歸一值為評價指標優化丹參總酚酸的提取工藝，結果表明，建立的丹參總酚酸評價方法簡便、穩定、可行。同時，對本試驗所建立的最佳工藝與《中國藥典》工藝進行了比較:參照《中國藥典》2010年版一部所收載的丹參總酚酸提取物項下制備樣品，對其進行了丹酚酸B的測定，結果表明本試驗所建立的最佳工藝丹酚酸B轉移率高于《中國藥典》方法。采用星點設計結合效應面優化法優選中藥材等的提取工藝，考察因素的水平范圍更大，同時采用非線性數學模型擬合，復相關系數較高，可信度較好，預測值更接近真實值，本試驗的結果可以為進一步完善丹參總酚酸提取物制備方法的國家標準提供一定的參考。

3.2 星點設計結合效應面優化法所得結果更加直觀、便于分析。進一步分析本試驗擬合所得二項式方程及變量三維圖，試驗所設計的各因素中溶媒用量、溫浸時間與試驗結果成正相關，且溶媒用量影響較大;而溫浸溫度在一定范圍內成正相關，超過一定值后成負相關，且對試驗結果的影響大于溫浸時間。此結果與單因素預試驗所得結果趨勢相吻合，且所得的結果參數更加明確。本法更適合于探索性的試驗研究，且試驗結果精確度較高，在試驗設計中更具優勢。

3.3 本試驗中所建立的星點設計-效應面法優化丹參總酚酸的提取工藝，為丹參及其他中藥材的提取、加工和開發提供了參考和依據，也為進一步開發川產道地藥材奠定了基礎。

［1］張廷模.臨床中藥學［M］.上海:上?？茖W技術出版社，2006:244.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010.

［3］Wu X G，Li G，Gao Y L.Optimization of the preparation of nahnefene-loaded sustained-release microspheres using central composite design［J］.Chem Pharm Bull，2006，54(7):977-981.

［4］吳偉，崔光華.星點設計-效應面優化法及其在藥學中的應用［J］.國外醫學藥學分冊，2000，27(5):292-298.

［5］吳偉，崔光華，陸彬.實驗設計中多指標的優化星點設計和總評“歸一值”的應用［J］.中國藥學雜志，2000，35(8):530-533.

［6］趙艷玲，肖小河，山麗梅，等.星點設計-效應面法優選干姜提取工藝［J］.醫藥導報，2009，28(7):897-900.

［7］伍勇，賀福元，曹燕，等.星點設計-效應面優化法對四物湯醇沉工藝的研究［J］.中國醫藥導報，2009，6(3):17-19.

［8］孫磊，王玉蓉.星點設計-效應面法優選遠志的提取工藝［J］.中成藥，2006，28(3):329-332.

［9］吳云娟，沙先誼，李珺嬋，等.星點設計-效應面優化法優化三七總皂苷鼻腔用粉霧劑［J］.中成藥，2005，27(1):10-15.

［10］葉勇.比色法與高效液相色譜法對丹參酚酸含量測定比較研究［J］.浙江中醫藥大學學報，2006，30(4):350-351.