星點設計-效應面法優化美洲大蠊提取工藝

張臻，宋芹，傅超美*，高飛，徐曉秋，盛菲亞

(1.成都中醫藥大學藥學院，西部中藥材開發與利用教育部重點實驗室，四川成都611137;2.成都大學生物產業學院，四川成都610106)

美洲大蠊Periplaneta americana(L.)為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，入藥始載于《神農本草經》，謂“味咸，寒，治血瘀，癥堅，寒熱，破積聚，喉咽痹，內寒無子”［1］。《本草綱目》上記載其主治“瘀血，癥堅，寒熱，下氣，利血脈”，常用來治療小兒疳積、疔瘡、喉蛾、無名腫毒、膨脹、梅毒以及毒蛇、蜈蚣咬傷等疾病［2］。現代研究表明美洲大蠊化學成分眾多，主要分為兩大類:向體外釋放的具揮發性的信息素類成分，包括性信息素和聚集信息素;存在于機體內部的氨基酸和蛋白質類成分［3-5］。其中的氨基酸、蛋白質既是美洲大蠊中含有量較高的成分，亦是美洲大蠊藥效學的物質基礎［6］。因此，本實驗以干膏收率、氨基酸提取量、蛋白質提取量為評價指標考察美洲大蠊的提取工藝。

1 實驗材料

1.1 實驗藥材美洲大蠊藥材由四川好醫生藥業集團西昌美洲大蠊養殖基地提供，為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲美洲大蠊Periplaneta americana(L.)干燥蟲體。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器酶標儀(美國thermo公司);Mili-Q超純水處理儀(美國密理博公司);UV1100紫外可見分光光度計(上海天美科學儀器有限公司);恒溫干燥箱(上海森杏實驗有限公司，DGG-9240);電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司，DZKW-4);電子天平;電磁爐;96孔酶標板(NUNC MaxiSorp);蒸發皿。

1.2.2 試劑谷氨酸對照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號:G-025-110305);茚三酮(天津市瑞金特化學品有限公司，批號:110518);100T/96樣考馬斯亮藍試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:20110719);磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化亞錫均為分析純。

2 方法與結果分析

2.1 星點實驗設計根據文獻［7-9］和預試驗結果可知，影響美洲大蠊提取效果的主要因素是溶媒含乙醇量、提取時間和溶媒用量，因此，本試驗以干膏收率、氨基酸提取量、蛋白質提取量為指標設計水平范圍，見表1。

表1 影響因素與水平

2.2 提取試驗方法取美洲大蠊藥材25 g，精密稱定，按星點設計(表1)回流提取兩次，合并濾液，定容至500 mL，即得提取液，測其干膏收率、氨基酸提取量、蛋白質提取量。

2.3 干膏的測定取250 mL提取液置于已干燥至恒定質量的蒸發皿中，水浴揮干，殘渣于105℃烘箱干燥3 h，移至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量。由殘渣質量與相應藥材質量計算干膏收率。

2.4 氨基酸的測定

2.4.1 對照品溶液的制備取谷氨酸對照品適量，精密稱定，置于10mL量瓶中，加蒸餾水配制成1 mg/mL的對照品母液［10-11］。

2.4.2 供試品溶液的制備量取0.15 mL提取液置于25 mL量瓶中，依次加入pH8.0的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，2%的茚三酮溶液［10］1.0 mL，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加超純水定容至25 mL，即得。

2.4.3 方法學考察

2.4.3.1 線性關系考察取谷氨酸對照品母液，稀釋10倍作為工作溶液，再取工作溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于一組25 mL量瓶中，各加磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，2%茚三酮溶液1.0 mL，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加超純水定容至25 mL，放置10 min后，以吸光度對應質量濃度繪制標準曲線，得到一元線性方程:Y=35.15X－0.124 6，r2=0.999，在0.005～0.025 mg/mL范圍內呈良好線性關系。

2.4.3.2 精密度試驗精密量取谷氨酸對照品工作溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL各3份于一組25 mL量瓶中，按2.4.2項下方法處理工作溶液，測定吸光度，平行試驗3份，RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

2.4.3.3 穩定性試驗［12］分別精密量取谷氨酸對照品工作溶液3.0 mL置于量瓶中，按2.4.2項下方法處理工作溶液，分別于0.5、1.0、1.5、2 h測定吸光度，RSD值為2%，表明該方法在2 h內穩定。

2.4.3.4 重復性試驗平行制備6份樣品溶液，按以下公式［7］測定樣品總氨基酸質量分數:(W—氨基酸總量，%;C—根據標準曲線查得的谷氨酸量，mg;L1—測定用試樣量，mL;L2—試液總量，mL;M—試樣質量，g;m—試樣干物率，%)。計算美洲大蠊總氨基酸質量分數為4.35 mg/g，RSD值為2.5%，表明該方法重復性良好。

2.4.3.5 加樣回收率試驗取已知量的美洲大蠊藥材1 g，精密稱定6份，分別精密加入對照品適量，按2.4.2項下方法制備，測定并計算其平均回收率為99.36%，RSD值為1.52%。

2.4.4 氨基酸的測定取對照品或供試品置于25 mL量瓶中，加入pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，2%的茚三酮溶液1.0 mL，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加超純水定容。以相應試劑為空白，參照紫外-可見分光光度法，在570 nm處測定吸光度。

2.5 蛋白質測定方法以2.2項下所得提取液為樣品母液，按考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒說明書項下操作，分別配制空白液、蛋白標準液、樣品測定液。精密吸取每類溶液3份于3個酶標板孔中，每孔200 μL，放入酶標儀中測定各孔吸光度，按以下公式計算蛋白質質量濃度。蛋白質質量濃度×標準管質量濃度(0.563 g/L)

2.6 結果與分析

2.6.1 結果將干膏收率、氨基酸質量分數和蛋白質質量濃度3個指標均標準化為0～1之間的歸一值，各指標“歸一值”求算幾何平均值，得三者的總評“歸一值”(od)作為試驗結果，試驗安排及總評“歸一值”見表2。“歸一值”公式采用Hasson法［13］:

表2 試驗設計與結果

2.6.2 模型擬合采用Design-Expert7軟件對試驗數據進行分析，擬合回歸方程。多元線性回歸方程為:OD=0.48－0.19A－0.009 473B+0.1C(R=0.716 2，P=0.000 1)。二次多項式方程為:OD=0.55－0.19A－0.009 473B+0.1C－0.011AB－0.002 769AC－0.021BC－0.078A2－0.013B2－0.018C2(R=0.830 9，P=0.007 0)。由擬合結果中的置信度P值和相關系數R值而言，二次多項式模型相對于線性擬合有較大提高。

2.6.3 效應面法優化提取工藝參數根據上述二次多項式模型，分別繪制效應面和等高線，并優選3個因素的最佳取值范圍。結果見圖1～3。

圖1 OD值與A、B因素的效應面圖

圖2 OD值與A、C因素的效應面圖

圖3 OD值與B、C因素的效應面圖

根據效應面圖和等高圖，選取較佳工藝范圍:溶媒含乙醇量14.79%～18.0%，提取時間70～80 min，溶媒用量10～12倍。結合溶液配制的實際操作和工業生產可行性等因素，確定提取工藝的優化條件為:加入11倍15%的乙醇，提取75 min。

2.7 驗證試驗按該優選工藝進行提取3次，并比較預測值與真實值，結果見表3。

表3 最佳提取值范圍

3 結論

美洲大蠊優化提取條件為:取美洲大蠊藥材，加11倍量的15%乙醇提取兩次，每次75 min，星點設計-效應面法篩選美洲大蠊最佳提取條件方法可行，建立的數學模型預測值良好。

4 討論

4.1 氨基酸測定方法的確定經現代研究表明，美洲大蠊含有大量蛋白質、氨基酸、礦物質和微量元素等化學成分［14］，藥理功效眾多，如能抗腫瘤［15］、抗菌抗毒素、抗炎鎮痛。雖然其食用和藥用價值逐漸引起人們的重視，但對該藥的藥用價值評價指標的研究較少、穩定的評價方法也鮮見。根據對美洲大蠊的研究報道［16-17］，本試驗確定以氨基酸含有量作為評價指標之一來評價提取工藝優劣。但實驗中發現目前測定氨基酸的方法適用性差且重現性不好，不適用于測定美洲大蠊中的氨基酸，因此，在星點設計試驗前，通過預實驗對現有測定氨基酸的方法進行了改進，確定了制備供試品溶液時量取0.15 mL濾液來測定吸光度，所得的吸光度值在線性范圍內。最終建立的美洲大蠊中氨基酸定量測定的方法具穩定可行、重復性好、靈敏度高。

4.2 提取溶媒范圍的確定目前關于美洲大蠊有效成分的提取方法報道中主要溶媒有95%乙醇、90%乙醇、70%和水，因此本試驗以文獻報道中的溶媒進行了預實驗，結果表明使用較高含醇量的乙醇為溶媒時不利于干膏的提取和氨基酸、蛋白質的溶出，因此本試驗最終選取的溶媒范圍極限值為水和70%乙醇，旨在保證較高的指標成分提取率和較優的篩選范圍基礎上，通過星點設計-效應面法優化篩選出以干膏收率、氨基酸提取量和蛋白質提取量為評價指標時的最優溶媒提取含乙醇量。

［1］孫星衍，孫馮翼.神農本草經［M］.上海:商務印書館，1955:90.

［2］李時珍.本草綱目［M］.北京:人民衛生出版社，2000:1010.

［3］戴云，曾茗，項朋志.蜚蠊的藥用價值［J］.中藥材，2005，28(9):849.

［4］何正春，彭芳，宋麗艷，等.美洲大蠊化學成分及藥理作用研究進展［J］.中國中藥雜志，2007，32(21):2326-2331.

［5］鐘偉，殷幼平.蜚蠊聚集信息素的研究進展［J］.中國媒介生物學及控制雜志，2002，13(5):392.

［6］周瓊.美洲大蠊資源開發利用的研究［D］.福建:福建農林大學，2008.

［7］王文娣，王陽，王麗峰.星點設計-效應面法及正交實驗設計優化淫羊藿提取工藝的比較研究［J］.時珍國醫國藥，2010，21(11):2766-2768.

［8］鄒小艷，魏立新，杜玉枝，等.星點設計-效應面法優化川西獐牙菜提取工藝［J］.中草藥，2008，39(5):692-696.

［9］孫磊，王玉蓉.星點設計-效應面法優選遠志的提取工藝［J］.中成藥，2006，28(3):328-331.

［10］周國蘭，何萍，鄭文莉.茚三酮比色法測定茶葉中游離氨基酸總量方法存在問題的探討［J］.化學分析計量，2009，18(5):79-81.

［11］王玎瑋，李海波，蔣學云，等.美洲大蠊藥材中總氨基酸提取工藝優化研究［J］.大理學院學報，2008，7(12):3-5.

［12］陳曉曉.復方大黃結腸靶向雙層包衣片劑的制備及質量評價［D］.天津:天津大學化工學院，2008.

［13］宋英，樊敏偉.星點設計-效應面法優化穿心蓮滴丸制備工藝研究［J］.時珍國醫國藥，2008，19(7):1753-1754.

［14］楊芳，邵金良，汪慶平，等.美洲大蠊水解氨基酸含量測定及營養評價［J］.氨基酸和生物資源，2010，32(1):9-11

［15］張成桂，何正春，焦春香，等.美洲大蠊抗癌活性成分體外抗氧化活性分析［J］.時珍國醫國藥，2010，21(9):2249-2250.

［16］章麗，劉松雁.氨基酸測定方法的研究進展［J］.河北化工，2009，32(5):27-29.

［17］吳月娜，黃松，劉梅，等.青天葵中總游離氨基酸的提取工藝研究［J］.中國中醫藥信息雜志，2011，18(1):53-54.