天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用*

聶 晶,杜 亮,陸遠(yuǎn)富,石京山

(1.遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,貴州遵義 563000;2.貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州遵義 563000)

天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用*

聶 晶1,2,杜 亮2,陸遠(yuǎn)富1,2,石京山1,2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,貴州遵義 563000;2.貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州遵義 563000)

目的探討天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用機(jī)制?方法 采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型,缺血2h,再灌注24h后取大鼠大腦組織進(jìn)行HE染色觀察病理改變,TUNEL法計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞,Real time RT-PCR檢測(cè)胱天蛋白酶3(casepase-3)mRNA的表達(dá)?結(jié)果天麻素能明顯改善中動(dòng)脈閉塞所致局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織病理變化,減少細(xì)胞凋亡(P0.01),降低caspase-3mRNA的表達(dá)(P0.05)?結(jié)論天麻素可通過(guò)下調(diào)caspase-3mRNA的表達(dá)減少大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡,對(duì)缺血再灌注損傷大鼠腦組織發(fā)揮保護(hù)作用?

天麻屬;腦缺血;再灌注損傷;細(xì)胞凋亡;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

缺血性腦血管病是一種常見(jiàn)病和多發(fā)病,是目前嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一,因具高發(fā)病率?高死亡率?高致殘率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)而引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注與高度重視?腦缺血再灌注后以神經(jīng)元為主的壞死與細(xì)胞凋亡是腦損傷中重要的病理生理過(guò)程,其中細(xì)胞凋亡的重要作用日益受到重視?抑制細(xì)胞凋亡,可以減輕腦梗死的體積,這已成為缺血性腦血管病的治療靶點(diǎn)之一[1]?既往研究發(fā)現(xiàn)天麻素可明顯改善中動(dòng)脈閉塞所致局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能,明顯縮小梗死面積,降低腦含水量,對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用[2],因此,本研究擬在此基礎(chǔ)上觀察天麻素對(duì)大鼠凋亡誘導(dǎo)因子——胱天蛋白酶3(caspase-3)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響,進(jìn)一步探討其作用機(jī)制?

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?主要試劑及儀器 SD大鼠36只,雄性,體質(zhì)量(250±10)g,清潔級(jí),購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物中心[合格證號(hào):SCXK(渝)2007-0005],顆粒飼料飼養(yǎng),自由飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?天麻素購(gòu)自西安冠宇生物技術(shù)有限公司(純度:99.12%,批號(hào):GY20080822);尼莫地平片購(gòu)自山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司(20毫克/片,批號(hào):080510);RNA純化試劑盒?Real time RT-PCR試劑盒,以及βactin和caspase-3引物均購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司;原位末端標(biāo)記細(xì)胞凋亡試劑盒由德國(guó)Boehringer Mannheim公司提供?iMark通用酶標(biāo)儀和Icycler IQ型Real time RT-PCR為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品?

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備及給藥 將36只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組?模型組?天麻素低劑量組(15mg/kg)?天麻素中劑量組(30 mg/kg)?天麻素高劑量組(60mg/kg)及尼莫地平組(12mg/kg),每組6只大鼠?各組均于手術(shù)前1周每日上午09:00灌胃給藥,假手術(shù)組給予生理鹽水?采用大腦中動(dòng)脈閉塞和再灌注的方法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型[2]?

1.2.2 HE染色觀察腦組織病理形態(tài) 大鼠缺血2h,再灌注24h后麻醉斷頭取腦,以視交叉前后兩點(diǎn)冠狀切片,片厚約4 mm,將腦切片放入40g/L甲醛溶液中固定?常規(guī)梯度脫水,透明,包埋,浸蠟,切片(厚6μm),HE染色,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察組織學(xué)變化?

1.2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況[3]切片常規(guī)脫蠟至水,按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,DAB顯色2～5min,蘇木素復(fù)染,封片?于光鏡下觀察,TUNEL染色陽(yáng)性并伴有核染色質(zhì)濃聚,核染色質(zhì)靠邊凝集或凋亡小體形成者為凋亡細(xì)胞;TUNEL染色陽(yáng)性但呈彌漫著色為壞死細(xì)胞;TUNEL染色陰性為正常細(xì)胞?光鏡下隨機(jī)選取每張切片梗死周邊組織5個(gè)視野(×400)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)?

1.2.4 Real time RT-PCR檢測(cè) 按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA并純化,用 Real-time RT-PCR試劑盒檢測(cè)腦組織中casepase-3 mRNA的表達(dá)?各基因引物序列,β-actin,上游:5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′,下 游:5′-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3′;caspase-3,上 游:5′-AGG TCC AAG TTG CGC GTT TC-3′,下游:5′-CAG AAT GAG GAC TGG GTG AG-3′;總反應(yīng)體積為15μL?反應(yīng)條件為:95℃,10min→(95℃10s,60℃1min)×40個(gè)循環(huán)?目的基因的相對(duì)表達(dá)量以目的基因/內(nèi)參基因表示?

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以±s表示,采用單因素方差分析進(jìn)行組間檢驗(yàn),兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織病理改變的影響假手術(shù)組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,細(xì)胞密度大;模型組缺血側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)較疏松,間質(zhì)水腫,有散在空腔形成,且出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元變性?壞死,細(xì)胞間隙增寬,神經(jīng)元胞核形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞核固縮;天麻素低?中?高劑量組及尼莫地平組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)大致正常,病理改變輕微,壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞減少,海馬區(qū)可見(jiàn)錐體細(xì)胞,見(jiàn)插Ⅱ圖1?

2.2 天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織凋亡細(xì)胞的影響模型組大鼠可見(jiàn)大量TUNEL染色陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞,天麻素高?中劑量組和尼莫地平組能明顯減少腦缺血再灌注損傷大鼠

TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(P0.01),見(jiàn)表1?

表1 天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織凋亡細(xì)胞的影響(±s,n=6)

表1 天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織凋亡細(xì)胞的影響(±s,n=6)

##:P 0.01,與假手術(shù)組比較;**:P 0.01,與模型組比較?

組別 凋亡細(xì)胞數(shù)(個(gè))假手術(shù)組9.6±3.8模型組 48.2±9.7##天麻素低劑量組 45.8±5.3天麻素低劑量組 28.4±7.3**天麻素低劑量組 25.0±7.6**尼莫地平組 24.0±4.8**

2.3 天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織caspase-3mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織中caspase-3mRNA表達(dá)增加(P0.05);與模型組比較,天麻素中?高劑量組和尼莫地平組caspase-3mRNA表達(dá)降低(P0.05),見(jiàn)表2?

表2 天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織caspase-3 mRNA表達(dá)的影響(±s,n=3)

表2 天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織caspase-3 mRNA表達(dá)的影響(±s,n=3)

#:P0.05,與假手術(shù)組比較;*:P0.05,**:P 0.01,與模型組比較?

組別 caspase-3mRNA假手術(shù)組42.4±19.4模型組 166.6±44.7#天麻素低劑量組 118.5±18.0天麻素低劑量組 87.2±6.0*天麻素低劑量組 44.7±4.8**尼莫地平組 39.8±10.7**

3 討 論

腦缺血再灌注損傷后缺氧?水腫和神經(jīng)代謝產(chǎn)物釋放等病理改變引起的繼發(fā)性損傷是影響缺血性腦血管病患者預(yù)后的關(guān)鍵因素?缺血半暗帶內(nèi)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡是反映繼發(fā)性損傷程度的重要標(biāo)志,由于這些細(xì)胞仍然保留了部分蛋白合成能力并表達(dá)某些相關(guān)基因,如能及時(shí)給予保護(hù)治療,該部位的能量代謝及神經(jīng)組織則可能被挽救?否則就轉(zhuǎn)為不可逆損傷,使梗死灶擴(kuò)大?因此,治療重點(diǎn)在于挽救缺血半暗帶神經(jīng)組織,即如何保護(hù)受損神經(jīng)組織,減少細(xì)胞凋亡[4]?

凋亡是細(xì)胞自然殺傷過(guò)程,是保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)和維持穩(wěn)態(tài)的重要條件,其目的是去除各種異常?受損和癌變的細(xì)胞,在腦缺血再灌注損傷后,神經(jīng)元凋亡顯著增加?在腦缺血過(guò)程中,缺血半暗帶區(qū)的多種病理生理過(guò)程,包括自由基?鈣離子超載?炎性反應(yīng)及線粒體損傷都可以觸發(fā)細(xì)胞凋亡[1]?本研究中HE染色及TUNEL結(jié)果均顯示模型組凋亡細(xì)胞顯著增多,而天麻素能夠抑制細(xì)胞凋亡,凋亡可能決定梗死灶的體積,既往研究中發(fā)現(xiàn)天麻素可顯著減少腦缺血再灌注損傷大鼠的腦梗死灶面積,提示其減少梗死灶面積可能與其抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)?

細(xì)胞凋亡過(guò)程可以大致分為起始期?執(zhí)行期和死亡期3個(gè)時(shí)期?(1)起始期:細(xì)胞通過(guò)受體等途徑,接受內(nèi)外環(huán)境發(fā)出的凋亡信號(hào),將其傳遞給執(zhí)行器的過(guò)程;(2)執(zhí)行期:caspase-8?caspase-9?caspase-10激活,通過(guò)蛋白酶組成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活效 應(yīng) 子——caspase-3?caspase-6?caspase-7,后 者 通 過(guò) 激 活DNA酶等導(dǎo)致DNA的斷裂;(3)死亡期:DNA破壞的不斷增加,導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入不可逆的死亡?從理論上講,凡能阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞通路的每一個(gè)環(huán)節(jié)均有可能影響細(xì)胞凋亡的發(fā)展[5]?caspase參與細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo),其中caspase-3是凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶,是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路?腦缺血后,神經(jīng)元caspase-3mRNA表達(dá)增加?酶活性增強(qiáng),本研究中模型組大鼠腦組織中caspase-3mRNA表達(dá)明顯增高,而天麻素可降低caspase-3mRNA的表達(dá),抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡?

綜上所述,天麻素可能是通過(guò)下調(diào)caspase-3的表達(dá)減輕腦組織細(xì)胞凋亡,從而縮小腦梗死面積,對(duì)缺血再灌注大鼠腦組織發(fā)揮保護(hù)作用?

[1] 陳東麗,陳旭東,夏翠英.天麻對(duì)大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(3):148-150.

[2] 聶晶,杜亮,黃燮南,等.天麻素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].華西藥學(xué)雜志,2010,25(4):423-425.

[3] 王偉,景桂霞,趙新京,等.瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2011,32(1):128-130.

[4] 吳中亮,任寧.天麻素注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2008,24(3):204-207.

[5] 賈士奇,王軍,張紅霞,等.生姜對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(3):163-166.

Inhibitory action of gastrodine on the neuronal apoptosis after focal cerebral ischemia reperfusion*

,,,
(1.,,,563000,;2.,,563000,)

ObjectiveTo investigate the potential mechanisms of gastrodine on the focal cerebral ischemic reperfusion damage in rats.MethodsThe SD rats were administered with gastrodine by gavage once a day for 7days.The animals were then subjected to right-middle cerebral artery occlusion for 2hand reperfusion for 24h.Brain tissues were stained with hematoxylin-eosin.The number of neuronal apoptosis was assessed by terminal oxynucleotidyl transferase mediated dUTP biotin nick end labeling(TUNEL).The mRNA level of caspase-3was detected by Real time RT-PCR.ResultsCompared with the model group,gastrodine significantly attenuated the apoptosis and the expression of caspase-3of rats(P0.05).ConclusionGastrodine can improve the brain injury induced by focal cerebral ischemia-reperfusion in rats.The mechanisms appear to be partly due to the inhibition of apoptosis through the suppression of caspase-3expression.

gastrodia;brain ischemia;reperfusion injury;apoptosis;caspases

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.020

A

1671-8348(2012)18-1841-02

* 基金項(xiàng)目:遵義市紅花崗區(qū)科技局科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目[遵紅科合社字(2007)13號(hào)]?

2011-07-23

2011-12-25)

?臨床研究?