傷寒沙門菌核糖核酸酶G對胞內非編碼RNA T3956水平的影響

王菲，孟彥辰，詹莉芳，張曉磊，張海方，生秀梅，徐順高，黃新祥

近年來，隨著生物信息學和分子生物學技術的不斷發展，細菌中的非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)作為一類新發現的基因表達調控因子，已受到越來越多的關注［1］。過去長期認為RNA僅是把遺傳信息從DNA帶到蛋白質的一個過渡產物，然而目前大量的研究陸續發現細菌中一些非編碼小RNA，作為應答環境壓力的調節元件［2］，在細菌的物質代謝、環境適應、群體感應和細菌毒力等方面發揮著重要的調節作用［3-6］。絕大多數非編碼小RNA通過與靶mRNA配對，在轉錄后水平影響靶基因mRNA的翻譯或(和)穩定性，從而調節目的基因的表達，影響細胞的多種生理功能［2，7］。在細菌體內，這些ncRNA分子的活力主要受控于其胞內的水平。對大腸埃希菌和其他一些菌屬的研究表明，核糖核酸酶 E、G、Ⅲ主要參與對 ncRNA水平的調控［8］。因此，研究ncRNA分子在菌體內的水平是更好了解ncRNA作用的前提。

傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是一種嚴重的人類腸道致病菌，也是一種重要的研究原核基因表達與調控的模式生物。本室通過對傷寒沙門菌野生株GIFU10007在普通LB、氧應激、高酸、高鹽等不同生長條件下的基因轉錄譜分析、測序、生物信息學預測和實時定量PCR(qRTPCR)驗證，從中挑選出一個位于基因ftsX和t3957之間的非編碼區ncRNA分子，命名為T3956。我們通過實時定量PCR分析初步發現，在傷寒沙門菌RNase E、RNase G、RNaseⅢ三種主要核糖核酸酶的缺陷變異株中，T3956的胞內水平在核糖核酸酶G基因(rng)缺陷株中變化較為明顯。因此，本研究擬通過構建傷寒沙門菌rng缺陷變異株和rng缺陷回補株，并利用qRT-PCR分析RNase G對傷寒沙門菌胞內ncRNA T3956水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 野生型S.Typhi GIFU10007、E.coli SY372λpir和自殺質粒pGMB151由日本岐阜大學醫學院微生物學教研室饋贈;E.coli DH5α由本室保存;pGEM-T載體為Promega公司產品。

1.1.2 主要試劑與材料 DNA聚合酶 ExTaq、rTaq、限制性內切酶 BamH I、Xho I、BglⅡ、T4DNA連接酶、dNTP、DNase I、實時 PCR 均為 TaKaRa(大連)公司產品;DNA聚合酶pfu、RNase G為Fermentas(上海)公司產品，X-Gal、L-阿拉伯糖、氨芐西林為Sigma(美國)公司產品，TA克隆試劑盒為Promega(北京)公司產品;質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒為Axygen(美國)公司產品;總RNA提取試劑盒為Qiagen(德國)公司產品;逆轉錄試劑盒為Invitrogen(美國)公司產品。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像分析系統(Syngene);PCR擴增儀2720 Thermal Cycler(ABI);核酸檢測儀Speetrophotometer ND-100(NanoDrop);電轉化儀Gene Pulsero II(BIO-RAD9);超速冷凍離心機Centifuge 5417R(Eppendorf);熒光定量PCR儀CFX96TMReal-Time System(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據本室測定的傷寒沙門菌野生株GIFU10007基因組序列信息(未公布)，利用Oligo6軟件設計rng缺陷株引物、rng缺陷回補株引物和t3956 qRT PCR引物。rng缺陷株引物設計：依據GiFU10007基因序列顯示，rng基因全長1 488 bp，在rng基因上游和下游設計兩對特異性PCR引物F1A/F1B和F2A/F2B，以S.Typhi GIFU10007為模板，擴增出340 bp和728 bp的同源性片段(分別用F1，F2表示)。在F1B、F2A的5'端共有20個堿基互補配對通過PCR用以定向連接F1和F2片段，在F1A、F2B的5'端加BamH I酶切位點用以克隆F1和F2連接片段至自殺質粒。rng缺陷回補株引物設計：在rng基因上下游設計引物FA，FB，并在5'端分別加上 Xho I及 BglⅡ酶切位點用以連接pBAD/gⅢ載體。t3956 qRT PCR引物設計：根據本室對傷寒沙門菌野生株GIFU10007基因組中的t3956基因測序信息，在序列中間設計一段特異性引物，通過檢測熒光值來觀察該基因的表達情況。所用引物均由上海生工生物技術服務有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Sequences of primers

1.2.2 傷寒沙門菌rng缺陷株的制備 傷寒沙門菌rng缺陷變異株的制備過程主要參考文獻［9］。以傷寒沙門菌野生株基因組DNA為模板，用特異性引物F1A/F1B和F2A/F2B分別擴增出rng基因上下游同源性片段F1和F2。由于在F1B、F2A的5'端共有20個堿基互補配對，用酚仿-乙醇法純化后的F1和F2片段共同作為模板通過PCR獲得F1-F2定向連接產物。膠回收F1-F2片段后與pGMET載體連接，熱擊法導入E.coli DH5α，先用BamH I酶切和PCR檢測對疑似陽性克隆質粒作初步鑒定，再用DNA序列分析(測序由上海生工生物技術服務有限公司完成)予以進一步鑒定。用BamH I酶切陽性重組pMD18-T質粒，膠回收酶切片段(F1-F2)，通過T4DNA連接酶將其連接至自殺質粒pGMB151的BamH I酶切位點，用熱擊法導入E.coli SY372λpir，篩選疑似陽性克隆并用BamH I酶切和PCR檢測鑒定。通過試劑盒提取帶有目的片段F1-F2的陽性自殺質粒，用電擊法導入傷寒沙門菌野生株，并在5%蔗糖LB平板上進行同源重組。用引物F1A、F2B擴增同源性片段觀察重組現象，將連續4次傳代完全重組的菌株作為S.Typhi rng缺陷株。

1.2.3 傷寒沙門菌rng基因缺陷回補株的制備根據傷寒沙門菌野生株基因組序列信息，在rng基因上下游設計引物FA、FB，并在5'端分別加上Xho I及BglⅡ酶切位點，用高保真的DNA聚合酶pfu擴增出目的片段。純化目的片段后用Xho I及BglⅡ對其進行雙酶切反應，通過T4DNA連接酶將其與經同樣酶切的pBAD/gⅢ質粒4℃過夜連接。用熱擊法將酶切產物轉化至E.coli DH5α，篩選陽性克隆并用酶切和PCR進行初步鑒定，再用DNA測序分析驗證(測序由上海英駿生物技術服務有限公司完成)。試劑盒提取測序正確的陽性克隆質粒和空質粒pBAD/gⅢ(陰性對照)，分別電擊導入傷寒沙門菌rng缺陷變異株中，命名為rng缺陷回補株 Δrng(pBAD-rng)，空質粒對照株 Δrng(pBAD)。

1.2.4 細菌培養及總 RNA提取 分別挑取S.Typhi野生株、rng缺陷株、rng缺陷回補株和空質粒株單菌落于1 ml等滲LB培養液中，37℃振蕩(250 r/min)培養過夜，然后以1∶100分別轉接于20 ml等滲LB培養液中，37℃振蕩(250 r/min)培養至 D(600 nm)值各為0.2，0.8 和1.2，其中培養回補株和回補空質粒株的LB液體中需加入L-阿拉伯糖和氨芐西林，終濃度分別為0.5 mg/ml和100 μg/ml。將培養管冰上放置 10 min后離心(4 000 r/min，10 min，4℃)收集菌體，再用TE緩沖液洗菌體1次，離心(4 000 r/min，10 min，4℃)收集菌體。用總RNA提取試劑盒分別提取細菌總RNA，并用無RNA酶的DNA酶 I(37℃ 30 min，80℃ 2 min)消化殘余DNA，用核酸檢測儀檢測RNA，確定其濃度，同時進行瓊脂糖凝膠電泳，分析RNA的質量(要求rRNA條帶清晰且無殘余DNA)。

1.2.5 RNA逆轉錄與實時定量PCR(qRT-PCR)采用上述方法提取細菌總RNA后用特異性引物逆轉錄成 cDNA。逆轉錄體系和條件：4 μg總 RNA，4 μl特異性引物 t3965FB，1 μl dNTP 和 4 μl無 RNA 酶的ddH2O混合后65℃作用5 min，冰浴1 min，再加入 5 × Fs 緩沖液 4 μl，0.1 mol/L DTT 1 μl，RNase OUT 1 μl，SuperScript Ⅲ 1 μl，總體積 20 μl，逆轉錄反應條件為25℃10 min，50℃50 min，70℃15 min。然后按照TaKaRa公司的實時定量PCR試劑盒操作說明進行實驗。qRT-PCR的反應體系：逆轉錄產物 1 μl，t3956 上下游引物各 1 μl，混合物(含有 ExTaq DNA聚合酶、dNTP、PCR緩沖液和SYBR Green)17 μl。實驗重復3次，每次設置平行對照組，得到的qRT-PCR結果用One-way ANOVA進行統計分析。

2 結果

2.1 成功制備傷寒沙門菌rng缺陷變異株

以S.Typhi野生株GIFU10007的基因組DNA為模板，用特異性引物F1A/F1B和F2A/F2B進行PCR擴增，獲得了rng基因上、下游同源性片段F1和F2，分別為340 bp和728 bp(圖1a)。通過PCR得到長度約1 068 bp的F1-F2定向連接片段后進行TA克隆，對篩選得到的陽性克隆經酶切和PCR鑒定后，再進行DNA測序分析，結果顯示F1-F2連接產物序列與S.Typhi野生株GIFU10007的rng基因序列一致。將F1-F2片段成功克隆至自殺質粒后(圖1b)，提取帶有目的片段的自殺質粒電擊轉入S.Typhi野生株GIFU10007，然后在5%蔗糖LB平板上進行同源重組，得到僅有缺失972 bp的小片段菌株后，在普通LB平板上連續4次傳代均只有小片段出現(圖1c)，表明S.Typhi rng缺陷變異株制備成功。

圖1 傷寒沙門菌rng基因缺陷變異株的制備Fig 1 Preparation of the rng deleted mutant of S.Typhi

2.2 成功制備傷寒沙門菌rng缺陷回補株

以野生株基因組DNA為模板，用引物FA/FB進行PCR擴增，獲得rng基因回補片段大約1 588 bp(圖2a)。將擴增的目的片段經雙酶切后與表達載體pBAD/gⅢ進行連接，熱擊導入 E.coli DH5α中，對疑似陽性克隆進行酶切和 PCR鑒定后(圖2b)，再經DNA測序分析驗證，測序結果顯示插入的回補片段與目的基因完全一致。試劑盒提取測序正確的陽性克隆質粒和空質粒pBAD/gⅢ(陰性對照)，分別電擊導入傷寒沙門菌rng缺陷變異株中，用目的基因特異性引物FA/FB對回補株進行PCR擴增，結果顯示在回補株中獲得了目的基因的特異片段(圖2c)，說明含rng基因的載體成功轉入缺陷株中，即S.Typhi rng缺陷回補株制備成功。

圖2 傷寒沙門菌rng基因缺陷回補株的制備Fig 2 Rescue of rng in the rng deleted mutant of S.Typhi

2.3 qRT-PCR分析RNase G對胞內T3956水平的影響

為探討RNase G對傷寒沙門菌ncRNA T3956表達的影響，我們分別提取傷寒沙門菌D(600 nm)值為0.2，0.8 和1.2 時的總 RNA，并用 qRT-PCR 分析各時相野生株、rng缺陷株、回補株和空質粒株中T3956的水平。結果(圖3)顯示，當細菌處于對數早期即D(600 nm)為0.2時，各菌株的胞內T3956水平并無顯著差異;當D(600 nm)為0.8及1.2即對數生長中后期和穩態期時，rng缺陷株的T3956胞內水平均較野生株明顯增加(P＜0.01)。在各時相中，回補株與野生株之間、空質粒菌株與缺陷株之間的T3956胞內水平相似。結果表明，在傷寒沙門菌中RNase G可影響胞內ncRNA T3956的水平，并且在細菌對數生長中后期和穩態期時RNase G對T3956水平的影響更為明顯。

3 討論

核糖核酸酶類對ncRNA的成熟、降解和胞內水平起著重要的調控作用。目前，在大腸埃希菌中已發現的核糖核酸酶類有20多種［10］。在細菌中主要的核糖核酸酶有RNase E、RNase G和RNaseⅢ。RNase E是主要作用于單鏈RNA的核糖核酸內切酶，其羧基末端還可以與其他的酶類連接組裝成降解復合體，參與許多小RNA的降解［11］。RNase G由rng基因編碼，與RNase E起催化作用的氨基末端具有同源性。同RNase E一樣，RNase G主要降解單鏈RNA，并且多水解5'末端含有單磷酸基團的RNA和富含AU堿基的區域［12］。在大腸埃希菌中，RNase G和RNase E共同參與16S rRNA 5'端的成熟加工。盡管RNase G與RNase E的氨基末端具有同源性，但是兩者作用的酶切位點并不完全一致［13］。RNaseⅢ是一種作用于雙鏈RNA的核糖核酸內切酶，對sRNA和靶mRNA配對的雙鏈區進行切割，可以同時降解sRNA和其配對的靶mRNA［14］。另外，參與小RNA調控的核糖核酸外切酶還有聚核甘酸磷酸化酶(PolynucleotidePhosphorylase，PNPase)和聚腺苷酸聚合酶(PolyA polymerase I，PAP I)。PNPase和RNase E一起參與組成降解體，參與小RNA降解［15］。PAP I的多聚腺苷化作用可以影響大腸埃希菌GlmY sRNA的穩定性［16］。

圖3 qRT-PCR分析傷寒沙門菌核糖核酸酶G對非編碼RNA的影響Fig 3 qRT-PCR was performed to analyze the influence of RNaseG on the cellular level of non-coding RNA T3956 in S.Typhi.

在原核生物中，非編碼小RNA的胞內水平和生理作用往往受到多種核糖核酸酶的共同調控，不同核糖核酸酶的作用方式也各不相同［17］。例如，對鼠傷寒沙門菌的一種非編碼小RNA MicA的研究表明，其胞內周轉調控涉及兩種不同的作用機制，當MicA與靶mRNA配對后，RNaseⅢ可以同時降解MicA sRNA和靶mRNA，而對于未配對的MicA sRNA來說，RNase E則是參與游離MicA降解的主要因子，同時RNase E還可以招募其他因子如PNPase來參與游離MicA的周轉，控制MicA sRNA的胞內水平［18］。這些核糖核酸酶共同參與調控MicA sRNA轉錄后的水平，使其達到最適的水平，從而發揮對靶mRNA的調節作用。

本文研究了傷寒沙門菌RNase G對胞內ncRNA T3956水平的影響，實時定量PCR結果表明RNase G可以影響胞內ncRNA T3956的水平，并且在細菌的對數生長中后期和穩態期作用更加明顯，提示傷寒沙門菌中的RNase G對ncRNA T3956的胞內水平和周轉更新發揮著重要的調節作用，這對研究ncRNA T3956的生理功能有著重要的意義。但RNase G對T3956發揮降解作用的具體酶切位點和作用機制尚不清楚，以及有無其它的核糖核酸酶共同參與對胞內ncRNA水平的調控，還有待進一步的研究。

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