菊花的組織培養技術

肖志堅，紀 艷，劉德江，吳恒梅，羅志文

（佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007）

菊花（Chrysanthemum）原產中國，為菊科（Asteraceae）菊屬（Chrysanthemum）的多年生宿根草本植物，是世界著名的四大切花之一，具有極高的觀賞價值。菊花品種繁多，花色各異，是公園花展和家庭裝飾的主要花卉。目前菊花的繁殖一般采用扦插、分株等傳統方法，以及組織培養、離體快繁、工廠化生產等高新技術，可在短時期內獲得大量菊花種苗。筆者以菊花為材料，從培養基的制備，菊花外植體的選擇、滅菌和接種等方面探討了菊花的組織培養技術，以期為菊花在園藝植物工廠化生產中的應用提供理論依據。1 材料與設備

1.1 材料與試劑

選取無病毒、無病害、生長良好的菊花作為組織培養的材料，并準備制備MS培養基所需的試劑，如乙醇、1 mol/L 的 HCl、1 mol/L 的 NaOH、升汞、瓊脂、6-芐基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸(NAA)及蔗糖等。

1.2 設施與設備

菊花組織培養所需的設施有：培養基制備、滅菌和材料處理室、無菌接種室、組織培養室、種苗移栽培養室、培養架、花木栽培室（棚、陰棚、苗圃）。

菊花組織培養所需的設備儀器有：超凈工作臺或簡易接種箱、高壓滅菌鍋、解剖刀、鑷子、容量瓶、錐形瓶、培養皿、燒杯、封口膜、白線繩、牛皮紙、圓濾紙、解剖剪、天平。

2 最佳培養基的篩選

從多次的對比試驗中篩選出下列培養基。

叢生芽誘導最佳培養基：MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

叢生芽繼代最佳培養基：MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

最佳生根培養基：1/2 MS+0.1 mg/L NAA

3 培養基的制備

培養基配制過程為：

3.1 MS培養基母液的配制與保存

MS培養基母液包括：儲備液I（大量元素母液）、儲備液II（微量元素母液）、儲備液III（有機成分母液）、儲備液IV（鐵鹽母液）及植物激素母液（NAA母液和6-BA母液）。

儲備液I～III的配制方法為：按照表1的配方將每種試劑先分別溶解，再彼此混合，最后定溶至所需數量。儲備液IV的配制方法為：取FeSO4·7H2O5 566 mg和 Na2EDTA·2H2O 7 460 mg分別置于450 mL蒸餾水中，加熱攪拌使之溶解，然后將2種溶液混合，再加蒸餾水至1L。

表1 儲備液I～III的配方

植物激素母液的配制方法為：①0.1 mg/L NAA母液。稱取10 mgNAA，用少量95%乙醇或少量乙酸溶解后，用蒸餾水定溶至100 mL。②10 mg/L 6-BA母液。稱取100 mg 6-BA，用少量1 mol/mL的鹽酸溶解后，用蒸餾水定溶至100 mL。然后根據所需功能的不同，在MS培養基中加入不同量的NAA和6-BA母液，具體加入量見表2。

最后，將配制的所有母液放入冰箱保存，特別應注意將儲備液IV儲存于棕色瓶中。

表2 各功能培養基中植物激素母液加入量 mL

3.2 培養基的配制與分裝

1 L培養基的配制：分別取50 mL儲備液I，5 mL儲備液II，5 mL儲備液III和5 mL儲備液IV，1 mL NAA母液，2 mL 6-BA母液放入1 000 mL的燒杯中；另取1個燒杯（或不銹鋼鍋）加入700 mL蒸餾水、30 g蔗糖、7 g瓊脂，加熱使瓊脂溶化，再將溶解的瓊脂糖溶液倒入盛有各種母液的燒杯中，用蒸餾水定溶至1 L，混勻后測pH；用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調節pH至5.8，最后將培養基分裝到錐形瓶中。

誘導叢生芽和繼代培養，取50 mL的錐形瓶，每瓶注入20 mL培養基；生根培養取100 mL錐形瓶，每瓶注入30 mL培養基；分裝后用封口膜和線繩封口。

3.3 滅菌

待滅菌的物品有：培養基、無菌水和裝有濾紙的培養皿。

具體滅菌步驟是：先將蒸餾水裝入1 000 mL錐形瓶的3/4處，用封口膜和牛皮紙兩層封口；再將裝有濾紙的培養皿5個一包；然后，連同已分裝好的培養基一起放入高壓滅菌鍋內，在1.2個大氣壓下滅菌10～15 min，冷卻后備用。注意滅菌時間不得超過15 min，以免培養基變性。

4 菊花的組織培養技術

4.1 組培部位的選擇

菊花可再生植株的器官有很多，如莖尖、莖段、側芽、葉、花序軸、花瓣等。若以快速繁殖為目的，應采用莖尖和側芽，其次是花序軸；若以育種為目的，則應采用花瓣；若以脫毒為目的，則必須用莖尖。

菊花的初代培養最好在9月進行。以花序軸為材料時，應選取具備該品種典型特征的飽滿壯實的花蕾，最好是含苞待放的花蕾（內部無菌）。采摘后應做好表面滅菌，以便于無菌條件下剝離出花序軸，進而用于接種。

4.2 組培材料的滅菌

取開花前2～3 d將要開放的菊花花蕾，放入燒杯中，先用自來水沖洗10 min；然后在已滅菌的超凈臺上，用75%的乙醇浸泡30 s后，用無菌水沖洗2次，再用0.1%的升汞消毒10 min，用無菌水沖洗4～5次；最后放入已滅菌有濾紙的培養皿中，在無菌的條件下，進行剝離和接種。

4.3 接種

無菌接種前，應對無菌室進行全面消毒，包括超凈臺的滅菌及手的消毒（75%酒精棉消毒）。無菌接種過程應在酒精燈控制下進行。

具體接種步驟為：花蕾在培養皿中被濾紙吸干后，剝除花序軸外層花被，得到半球形的花序軸，把花序軸切成4塊，每個錐形瓶放入2塊，正面向上，封口后送進組培室。培養室的溫度應保持在24～26℃，相對濕度應保持在60%～70%，每天應保證12 h的光照，光照強度約為1 500 Lx，也可使用自然光。3 d后外植體膨大，12 d后分化出芽，30 d后芽分化基本停止，當芽苗達2 cm時即可轉瓶進行繼代培養。

4.4 繼代培養

繼代培養4～5周為1次，增殖倍率均在5～10倍以上，繼代次數在10次左右芽苗均較理想。繼代5次后，選取一部分芽苗進行生根培養和移植栽培，另一部分芽苗繼續繼代增殖。

通過調整6-BA濃度控制芽苗的增殖倍率，前幾次繼代時，6-BA濃度可以高一些；接近選用芽苗生根時，6-BA的濃度可以低一些，使芽苗的增殖倍率下降，生長健壯，以利于生根和移栽。6-BA的添加范圍為0.1～1.5 mg/L。

轉接方法為：在無菌條件下，使用2個50 mL錐形瓶進行轉接，用酒精燈控制瓶口，防止雜菌進入瓶中造成污染；將具有芽苗的錐形瓶打開，用解剖刀或剪刀切取1株芽苗接種至裝有新培養基的錐形瓶中，每瓶接芽苗1株，封口后移至培養室中繼續培養。培養條件與誘導培養時相同，光照強度可以提高一些。

4.5 生根與移栽

在增殖培養基中培養30 d，芽苗達3 cm時，將單株嫩芽切下，插入生根培養基中培養。生根培養使用100 mL的錐形瓶，以利于培養大苗壯苗。生根培養基中不加6-BA，因為6-BA利于生芽，NAA利于生根。一般培養2周，即可生根；生根培養4周，根長＞1 cm時，出瓶移栽。

移栽前，將芽苗生根的錐形瓶移至種苗移栽培養室內煉苗6 d，前3 d將瓶口打開一半，后3 d將瓶口完全打開，以使芽苗逐步適應培養室環境。另外，應準備培養箱和基質，培養箱長55 cm，寬37 cm，栽植的株行距為4 cm×6 cm；基質的成分為田園土、沙、腐葉及腐熟的豬糞，比例為5︰2︰2︰1，并經暴曬消毒；培養室溫度控制在24～26℃，相對濕度控制在80%左右，適當遮陽。

移栽時，用鑷子將小苗輕輕取出，在清水中將依附于小苗根部的培養基洗凈，輕輕栽于培養箱的基質中；使用小型營養缽，每缽1株，栽后放置于架上培養；栽后開始階段覆膜保濕；移栽7 d后，芽苗即可成活；當苗長到一定大小時，根據生產目的移至棚、室或花圃進行栽培管理。

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