超聲-β-CD協(xié)同提取橘葉黃酮

李志英，何云飛

（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000）

橘葉為蕓香科植物及其栽培變種的干燥葉。橘葉中含有大量具有抗氧化活性的黃酮類物質(zhì)，是一種潛在的外源性抗氧化劑原料。橘葉中的黃酮類化合物對治療冠心病、心絞痛、高血壓都有顯著效果，具有降低血脂，抗菌消炎，抗白血病等多種功效。可有防治由于血管老化和腦血管供血不足所致的疾病[1]。

環(huán)糊精（CD）具有疏水性的內(nèi)腔和親水性的表面，是超分子化學(xué)中的基礎(chǔ)物質(zhì)之一，它具有的包合特性使其在理論和實(shí)際應(yīng)用中得到迅速發(fā)展[2]。尤其在醫(yī)藥方面，CD 和CD 衍生物與傳統(tǒng)藥物載體材料相比，無毒，性質(zhì)穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)獨(dú)特，可用于提高藥物溶解度和穩(wěn)定性，增強(qiáng)藥物利用率[3]。方法簡便，效果明顯，便于產(chǎn)品加工。

近年來超聲波提取方法作為一種優(yōu)良的提取方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然植物中有效成分的提取[4]。本實(shí)驗(yàn)通過含有β-CD 介質(zhì)中超聲輔助提取橘葉中的黃酮，代替了傳統(tǒng)的水浸法，醇提法，有效的提高了橘葉中黃酮的提取效率。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

AL104 電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-2550 紫外可見分光光度計(jì)：島津公司，蘇州；HK-1D 型恒溫水槽：南京大學(xué)應(yīng)用物理研究所；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

橘葉（購自忻州五臺山藥房）：自然干燥，粉碎，過60 目篩，備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（A.R.北京化學(xué)試劑公司）：準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品40 mg，用無水乙醇溶解于50 mL小燒杯中，然后用30%的乙醇定容于100 mL 容量瓶中，配制成0.4 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液；β-環(huán)糊精（A.R.）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 橘葉中黃酮的提取方法

稱取處理好的橘葉粉末1.000 0 g 置于50 mL 圓底燒瓶中，加入0.100 0 g β-CD，40%的乙醇30 mL，在溫度60 ℃，功率50%，超聲提取4 min，用40%的乙醇定容到50 mL 容量瓶，離心，備用。

1.2.2 橘葉中黃酮的測定方法

精確吸取提取液2 mL 于25 mL 比色管中，加入30%的乙醇5.0 mL 后，再加入5%亞硝酸鈉1 mL 靜置6 min，繼續(xù)加入10%硝酸鋁1 mL 靜置6 min。然后加入4 %氫氧化鈉5 mL，用30 %的乙醇定容后放置10 min。在510 nm 處以試劑空白為參比測量其吸光度。實(shí)驗(yàn)確定回歸方程為：A=0.010 7c+0.062 8（g/mL），相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，按此方程求得提取液中黃酮的質(zhì)量，按下式計(jì)算黃酮的提取率：

黃酮提取率的計(jì)算公式：

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收波長的測定

取25 mL 的兩支比色管，一支加入0.4 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，另一支加入提取液1 mL，按1.2.2 的實(shí)驗(yàn)方法，以試劑空白為參比，在紫外可見分光光度計(jì)下測定其吸收光譜，結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁及提取液的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of rutin and extract

由圖1 知，蘆丁的最大吸收波長為510 nm，在β-CD 存在下，吸收光譜紫移16 nm，吸光度增加了3 倍，光譜的變化說明β-CD 在黃酮提取中和黃酮發(fā)生了作用[6]。吸光度的變化說明提取率的增加。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 不同介質(zhì)下橘葉黃酮提取率的影響

稱取處理好的1.000 0 g 橘葉3 份置于3 個50 mL容量瓶中。其它條件不變，改變介質(zhì)為20 mL40%的乙醇，0.100 0 gβ-CD，0.100 0 g 羥丙基-β-CD，按1.2 的實(shí)驗(yàn)方法測定以上3 種提取液的提取率。結(jié)果如表1。

表1 不同提取介質(zhì)中提取率Table 1 Result of different medium

由表1 知，在相同條件下，比較3 種介質(zhì)下超聲輔助提取橘葉中的黃酮的提取效果，β-CD 溶液中提取效果最好，其原因可能是β-CD 和黃酮類化合物形成包和物，增加了黃酮類物質(zhì)的溶解度，因此，本研究選擇β-CD 為提取介質(zhì)。

2.2.2 β-CD 用量的選擇

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 橘葉粉末，其它條件不變，只改變β-CD 的量，m（橘葉）：m（β-CD）為1∶0.2，1∶0.4，1∶0.6，1∶0.8，1∶1 得提取液。按1.2.2 的實(shí)驗(yàn)方法，測其吸光度，結(jié)果見圖2。

圖2 β-CD 的用量的影響Fig.2 Effect of β-CD on extraction rate

由圖2 可知，隨著加入β-CD 的量不斷增加，黃酮得率先增大后降低之后又增大，總體看來β-CD 的量對黃銅提取率影響不大，考慮其節(jié)能方面及提取率，取最佳β-CD 量為m（橘葉）：m（β-CD）=1：0.2。

2.2.3 超聲提取時間的選擇

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 橘葉粉末，其它條件不變，改變提取時間為2、4、6、8、10 min，按1.2.1 的實(shí)驗(yàn)方法提取，按1.2.2 的實(shí)驗(yàn)方法測其吸光度。結(jié)果見圖3。

圖3 超聲溫度對提取率的影響Fig.3 Effect of time on extraction rate

由圖3 知，隨著超聲提取時間的增大，提取率先增大后減小。原因可能是由于提取時間過長，部分黃酮分解等原因造成[7]。選4 min 為最優(yōu)超聲提取時間。

2.2.4 超聲提取功率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 橘葉粉末，其它條件不變，改變超聲功率：40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %，按1.2.1 的實(shí)驗(yàn)方法提取，按1.2.2 的實(shí)驗(yàn)方法測其吸光度。結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate

由圖4 知隨著超聲提取功率的增大，橘葉中黃酮得率先增大后降低，功率為90%時又稍增大。考慮其節(jié)能方面及提取率，故取50%為最優(yōu)超聲提取功率。

2.2.5 超聲溫度對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 橘葉粉末，其它條件不變，改變提取溫度為40、50、55、60、65、70 ℃。按1.2.1 的實(shí)驗(yàn)方法提取，按1.2.2 的實(shí)驗(yàn)方法測其吸光度。結(jié)果見圖5。

圖5 超聲溫度對提取率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction rate

由圖5 知隨著超聲溫度的升高提取率先增大后減小。可能由于溫度太高部分黃酮分解等原因造成[8]。綜合考慮其影響，選取60 ℃為最佳超聲溫度。

2.2.6 料液比對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 橘葉粉末，其它條件不變，設(shè)置不同料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（g/mL）得提取液。按1.2.2 的實(shí)驗(yàn)方法測其吸光度。結(jié)果見圖6。

圖6 料液比對提取率的影響Fig.6 Effect of solid to liquid ratio on extraction rate

由圖6 知隨著料液比的增大，提取率逐漸降低。綜合考慮其影響，選取1∶30（g/mL）為最佳料液比。實(shí)驗(yàn)用20%、30%、40%、50%、60%的乙醇為提取溶劑，按1.2 的實(shí)驗(yàn)方法提取并測定，結(jié)果表明：40%的乙醇為最佳提取溶劑。

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，由于β-CD 量影響不大。故選出影響黃酮提取得率的4 因素：超聲溫度，料液比，超聲提取功率，超聲提取時間進(jìn)行優(yōu)化組合，以所測得吸光度為查考指標(biāo)，采用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)選出超聲輔助β-CD 水溶液提取法提取橘葉中黃酮的最佳工藝參數(shù)。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 L9（34）Results of orthogonal experiments

由極差分析可知，各因素對黃酮類化合物提取影響因素大小為：A（超聲溫度）＞C（超聲提取功率）＞B（料液比）＞D（超聲提取時間）。故最佳試驗(yàn)方案是：A2B1C2D3，即超聲提取時間為6 min，提取功率為50%，料液比為1∶30（g/mL），超聲溫度60 ℃。計(jì)算在此條件下的黃酮提取率為：6.67%。

2.4 對比實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取1.000 g 橘葉樣品3 份，在料液比為1 ∶30（g/mL），超聲與加熱溫度均為60 ℃，分別用40%的乙醇浸取，40%的乙醇超聲提取，加β-環(huán)糊精的40%乙醇溶液超聲提取，分別做三次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由表3 可知，在相同提取條件下，β-環(huán)糊精的40%乙醇溶液超聲提取率大于40%的乙醇超聲提取率大于40%的乙醇提取率，說明β-環(huán)糊精能有效增加黃酮類物質(zhì)在水中的溶解度。

表3 對比實(shí)驗(yàn)Table 3 Compaison of experiments

最佳工藝條件下黃酮的提取率為6.67%，與單因素測定值基本相符，證實(shí)了該方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。在此條件下提取3 次，黃酮的提取率見表4。

表4 最佳工藝條件及其驗(yàn)證Table 4 Results of validation experiments under optimized extraction conditions

經(jīng)過三次提取，總提取率為6.67%，與測定值相符。

3 結(jié)論

超聲技術(shù)用于橘葉中黃酮的提取，具有操作簡便、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)。最佳提取條件為用40%的乙醇在料液比1 ∶30（g/mL），m（β-CD 的用量）：m（橘葉）為0.2 ∶1，超聲功率50%，超聲溫度60 ℃，提取4 min，在此工藝條件下提取率為6.67%，與傳統(tǒng)方法相比，提取時間縮短了90%，黃酮提取率提高了70%。

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