淀粉仿生消化法的建立及其應用

宋彥顯，閔玉濤

（中州大學化工食品學院，河南鄭州450044）

糖尿病是目前威脅人類健康的主要慢性病之一，患者中約95%為Ⅱ型（非胰島素依賴型），其主要癥狀表現為餐后高血糖。餐后高血糖是心血管疾病患者死亡的獨立危險因素，另外，餐后血糖越高，糖尿病微量蛋白尿和視網膜病變的發生率也越高。因此，控制好餐后血糖很重要。體內淀粉等碳水化合物在α-淀粉酶催化作用下轉化為糊精和麥芽糖，后者進一步水解為葡萄糖，經小腸吸收進入血液，可導致餐后血糖上升。

食品在防治糖尿病方面的重要性不亞于藥物，并有藥食同源的優勢，抗性淀粉在這一領域中具有特殊的意義。抗性淀粉（RS）是一種新型的低熱量功能性食品基料，它不能被小腸中的淀粉酶類水解，因而可延緩餐后血糖升高[1]。美國專利（US2006025381A1）宣稱它可以調節和控制餐后血糖[2]。因此其研究和實驗方法就成為該領域的重要內容，不管是各種淀粉制備優化條件的分析跟蹤，還是不同種類淀粉材料抗性的對比和評價都離不開可靠的分析實驗方法。在動物實驗和人體實驗之前，體外實驗可以節省大量的人力和金錢，是篩選和發現各種新型抗性食品材料的重要手段。

本文采用仿生實驗條件并與特定的糖分析方法相結合，構建了淀粉的體外消化模型，是傳統經典方法的一個很好的補充，并在交聯淀粉消化研究中進行了應用，為新型降糖因子的研究與開發提供了實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬胰α-淀粉酶，比活力2 433 nkat/mg，中州大學生物工程實驗室自制；所用試劑均為化學分析純。

1.2 儀器與設備

721 紫外可見分光光度計：上海第三分析儀器廠；ZHP-160-恒溫振蕩培養箱：江蘇省金壇市漢康電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉仿生消化法的建立

1.3.1.1 淀粉體外消化條件的模擬

1 %的淀粉糊，煮10 min，冷卻至35 ℃左右，取1 mL 放入透析袋中，加入0.5 mL 的α-淀粉酶，置pH6.9 的PBS 緩沖液中，置37 ℃恒溫振蕩培養箱中透析3 h，轉速20 r/min，每30 分鐘取透析液一次，每次0.5 mL，稀釋至適當濃度，分別置于6 支試管中，以緩沖液為空白樣，進行檢測。

1.3.1.2 檢測波長的選擇

取5%的檢測樣品溶液0.5 mL，放入25 mL 比色管中，加苯酚液1 mL，搖勻，并迅速垂直加入5 mL 濃硫酸，再次搖勻，室溫放置30 min，分光光度計進行波長掃描。

1.3.1.3 苯酚及硫酸用量的選擇

取0.5 mL 檢測樣品液5 份，分別加入苯酚液0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，加水至等體積，分別加入5 mL 濃硫酸，室溫放置30 min 后，在485 nm 波長下測吸光度值。另取樣品液0.5 mL（5 份），分別加苯酚液1.0 mL，再分別滴加濃硫酸2、3、4、5、6 mL 并加水至等體積，以上法測吸光值。

1.3.1.4 檢測波長的確定

在最佳的反應條件下進行二次掃描，確定最終檢測波長[2]。

1.3.1.5 反應溫度的選擇

取0.5 mL 同一濃度的樣品液9 份，分別加入1．2．3所確定的苯酚及硫酸用量，置室溫（25 ℃）、70 ℃、100 ℃各3 份，保溫30 min 后冷卻5 min，485 nm 測吸光度值。

1.3.1.6 反應時間的選擇

取樣品液0.5 mL，在優化反應條件下反應，每隔一定時間于485 nm 處測吸光度值，以達到吸光度值穩定的最短時間為最佳反應時間。

1.3.1.7 顯色穩定性實驗

在最佳反應條件下每間隔一定時間檢測一次受試樣品吸光度值，考查受試樣品顯色后的穩定性。

1.3.1.8 線性關系的考查及標準曲線的繪制

將 系 列 濃 度（0.5、1、5、8、10、30、40、50、60、80、100、200、300、400、500 mg/mL）的葡萄糖溶液，各取0.5 mL，以蒸餾水為空白對照，按上述方法顯色檢測，以糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制曲線，再以直線部分做出標準曲線，并求出線性回歸方程及相關系數。

1.3.2 土豆交聯淀粉的制備

1.3.2.1 交聯淀粉的制備

取一定量土豆淀粉，溶于氫氧化鈉（淀粉干質量的1.5%）溶液中，置于50 ℃恒溫水浴鍋中，機械攪拌加熱3 min～5 min 后，將含有一定量的環氧氯丙烷（淀粉干質量的0.58%）的堿液滴加到淀粉乳中，中途不斷攪拌，反應6 h。用稀鹽酸調節pH 至7.0，靜置30 min后，3 000 r/min 離心10 min，共4 次，去除上清液，將底部沉積物轉移到搪瓷盤中，置干燥箱中55 ℃干燥，研磨，即為交聯淀粉。

1.3.2.2 沉降積的測定

稱取0.500 g 交聯淀粉，放入100 mL 的燒杯中，加蒸餾水稀釋至2%，將燒杯置于82 ℃～85 ℃水浴加熱，稍加攪拌，保溫2 min，取出冷卻至室溫。取10 mL 糊液置于帶刻度的離心管中，4 000 r/min 離心2 min，將上清液轉入10 mL 量筒中，讀值，計算沉降體積。沉降積計算公式為：S=10-V，式中：S 為沉降積，mL；V 為上清液體積，mL。

1.3.3 土豆交聯淀粉體外消化性能研究

參照1.3.1 構建的消化模型，進行土豆交聯淀粉體外消化性能研究。

2 結果與討論

2.1 淀粉體外消化條件的優化

2．1.1 淀粉體外消化條件的模擬

在體外模擬體內的消化條件，以透析袋模擬腸道，以恒溫振蕩培養箱保持37 ℃恒溫模擬體溫，以pH6.9 緩沖液模擬消化道的pH，以20 r/min 的轉速振蕩代替腸的蠕動，而透析袋透析出來的分子量切割10 000 以下的物質相當于寡糖、單糖，分別是消化過程中第一步和第二步的產物，采用硫酸-苯酚法對其進行測定即可得知淀粉的消化情況。

2.1.2 檢測波長的選擇

樣品掃描色譜，見圖1。

由圖1 可看出在485 nm 處有最大吸收峰。

2．1.3 苯酚及硫酸用量選擇

采用硫酸-苯酚法測出的寡糖和單糖的總和。菲林法和DNS 法測定的是可溶性還原糖，見表1、表2。

表1 苯酚用量選擇Table 1 Phenol dosage selection table

表2 硫酸用量選擇Table 2 Sulfate dosage selection table

由表1、2 可知，苯酚及硫酸用量分別選擇0.6 mL，4 mL 為宜。

2．1.4 檢測波長的確定

苯酚及硫酸用量選擇后的色譜，見圖2。

與圖1 相比，發現最大吸收波長并沒改變，仍為485 nm，所以最終確認檢測波長為485 nm，由于在最大波長處信噪比最大，靈敏度最高，所以選擇檢測波長在最大吸收波長。

2．1.5 反應溫度及時間的選擇

不同反應溫度下的吸光度，見表3；不同反應時間下的吸光度，見表4。

表3 不同反應溫度下的吸光度Table 3 The absorbance values at different reaction temperatures

表4 不同反應時間下的吸光度Table 4 The absorbance values of different time

由表3 可知，100 ℃下吸光度值最大，由表4 可知，反應30 min 后吸光度值基本穩定，因此反應溫度選擇100 ℃，反應時間定為30 min。

2．1.6 顯色穩定性實驗

不同時間的吸光度值，見表5。

表5 不同時間的吸光度值Table 5 The absorbance values of the different time

由表5 可知，2 h 內顯色基本穩定。

2．1.7 線性關系的考查及標準曲線的繪制

線性關系的考查及標準曲線的繪制，見圖3、圖4。

由圖3 圖4 可看出糖濃度在0～80 μg/mL 范圍內線性關系良好，其回歸方程為y = 0.004 4x - 0.005，R2=0.998 8。

2.2 交聯淀粉沉降積的測定

對土豆交聯淀粉的沉降積進行測定，結果見表6。

表6 交聯淀粉沉降積測定結果Table 6 Crosslinked starch settlement plot measurement results

從表6 結果可知交聯淀粉沉降積由小到大依次為5、3、7、8、6、1、4、9、2.沉降積越小，交聯度越高，由此可知，5 號交聯淀粉的交聯度最高，其次是3、7 號。

2.3 淀粉消化性能的測定

根據線性回歸方程y=0.004 4x-0.005，R2=0.998 8計算得結果見圖5。

圖5 表明，土豆交聯淀粉顆粒消化性能的變化趨勢與原淀粉糊基本相同，隨著消化時間的不斷增加，消化產物量不斷增大，平均消化速度不斷減小，但其數值遠遠小于原淀粉糊的數值。在體外模型系統（In-Vitro）中測定它們在不同消化時間的消化產物，結果如圖1 和圖表5 所示。隨著消化時間的延長，土豆淀粉及微細化樣品的消化產物不斷增加，平均消化速度則不斷減慢。這是因為α-淀粉酶是內切酶，能無規則地水解淀粉分子中的α-1，4 葡萄糖甙鍵。在水解初期，淀粉糊中龐大的結構松散的分子很容易被切斷成較小的分子，水解速度較快[3]。但隨著淀粉鏈變短，酶作用底物的結合點也相應減少，且α-淀粉酶不能水解淀粉的α-1，6 葡萄糖甙鍵，使水解速度迅速減慢[4]。

采用In-Vitro 系統測定它們及原淀粉顆粒的消化速度，結果如表5 與圖1 所示。結果表明高交聯度的土豆淀粉的消化速度要明顯慢于低交聯度及原土豆淀粉。隨交聯度的增大，消化速度不斷降低。

影響In-Vitro 消化系統中淀粉顆粒消化速度的因素主要來自兩方面：一是唾液α-淀粉酶與淀粉顆粒的酶促反應速度；另一原因是消化產物在滲析袋中的擴散和滲析速度。唾液α-淀粉酶與淀粉顆粒作用為固液兩相反應，酶分子首先由液相擴散到淀粉顆粒表面，使酶活性中心與淀粉分子鏈的特定區域結合并定位；然后酶分子的催化部位再進行催化淀粉水解的作用。顯然，由于變性處理而導致的淀粉分子結構和組成的變化會不可避免地影響酶促反應各步的進行，從而影響淀粉顆粒對淀粉酶作用的敏感性。當較低交聯度時，交聯鍵的分布極其稀疏即交聯密度很小[5]。唾液α-淀粉酶是分子內切酶，它以無規則的方式深入淀粉分子鏈的內部對淀粉分子進行水解，所以較低交聯度并不會阻礙唾液α-淀粉酶對淀粉分子的攻擊。隨著交聯度的增加，交聯的空間位阻逐漸體現出來，因而消化速度逐漸降低。此外這些淀粉樣品的消化速度均隨消化時間延長而降低，是因為可與唾液α-淀粉酶作用的合適分子鏈大小的淀粉分子不斷減少的緣故。

3 結論

1）以恒溫箱振蕩培養箱保持37 ℃恒溫，以pH6.9緩沖液維持恒定的pH，以20 r/min 的轉速振蕩模擬腸胃的蠕動，以透析袋模擬腸胃，在體外模擬體內的消化條件，建立In-Vitro 仿生消化法。

2）消化性能最佳測定條件：波長485 nm，顯色溫度100 ℃，顯色時間30 min，且其樣品液在2 h 內顯色穩定。

3）以葡萄糖作標準品，糖濃度在0～80μg/mL 范圍內線性關系良好，其回歸方程為y=0.004 4x-0.005，R2=0.998 8。

4）原土豆淀粉經交聯后其消化性降低13.7 %～34.5%，且交聯度與消化性呈負相關性，即交聯度越高（沉降積越小），消化性能越低。

[1] 許安邦.食品分析[M].北京:中國輕工業出版社,1994:371-372

[2] 郭勇,鄭穗平.酶學[M].上海:華南理工大學出版社,2000:84-90

[3] 張力田．變性淀粉[M]．廣州:華南理工大學出版社,1991:138

[4] 張鐘,華平,王立權．羧甲基淀粉作酸奶穩定劑的應用效果研究[J]．飲料工業,2004(4):391

[5] 王顯倫,文向前,張文.淀粉及變性淀粉對面條品質影響研究[J].鄭州糧食學院學報,2000(9):44-46