酶解超聲輔助卵磷脂的提取工藝

趙彥巧，李建穎，吳子健，王文忠

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

蛋黃卵磷脂在我國的市場占有量還非常少。隨著人民生活水平的提高，大力開發卵黃卵磷脂提取技術，提高雞蛋的加工水平和商品價值，改善蛋黃卵磷脂工藝，使其產率提高，降低成本成為迫在眉睫的任務。目前制備蛋黃卵磷脂一般采用有機溶劑萃取法、柱層析法、乙酰化法[1-2]，超聲輔助和酶解法可以使產率大大提高[3-4]。

本實驗中將采用酶解超聲輔助法提取蛋黃卵磷脂。以蛋黃粉為原材料，選擇胃蛋白酶最佳濃度后對超聲條件進行選擇，并通過正交實驗確定蛋黃卵磷脂的提取最佳工藝，提高卵磷脂的提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

蛋黃粉：購于北京金健力蛋粉廠；鉬酸銨、磷酸二氫鉀、1-氨酸-2-萘酚-4-磺酸、亞硫酸氫鈉、無水亞硫酸鈉、四硼酸鈉（pH 9.18）、混合磷酸鹽（pH 6.86）、乙醇95%、無水乙醇等試劑：購于天津市江天化工技術有限公司，皆為分析純；丙酮、硫酸：購于天津市化學試劑批發公司，分析純；胃蛋白酶：購于中國上海化學試劑有限公司，酶活力（U/g）≥1 200.0。

FA1004 型電子分析天平：上海精密科學儀器有限公司；BKH-C 玻璃儀器氣流烘干器：長城科工貿有限公司；DGG-H-3 型電熱鼓風干燥箱：天津市天宇實驗儀器有限公司；RE-52A 旋轉蒸發儀：上海亞英生化儀器廠；SK5210LHC 超聲波清洗器：上海科導超聲儀器有限公司；XMTD-204 型數顯式電熱恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；PHS-3B 型精密pH 計：上海精密科學儀器有限公司；UV-7504 型紫外可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；DL-6000 型低速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.2 提取實驗方法

取一定量蛋黃粉，加入去離子水并不停攪拌，使蛋黃粉充分攪勻。用鹽酸調pH 至2，加入胃蛋白酶充分攪拌，使其酶解。待酶解反應充分后，對酶解液進行破乳[4]，用氫氧化鈉調pH 至5，90 ℃水浴15 min。所得蛋黃液離心15 min（4 000 r/min），獲取第二層膠狀脂質體。取一定量酶解離心后的膠狀脂質體，加入溶劑進行超聲提取，超聲頻率35 kHz。提取液旋蒸后，得粗卵磷脂，粗卵磷脂乙醇溶液用丙酮洗滌多次，直至洗滌液無色，真空干燥即得精制卵磷脂。

1.3 卵磷脂的分析方法

由于卵磷脂是一種含磷的生理物質，因此采用鉬藍比色法測定卵磷脂含量，即用鉬酸銨定磷法測定產品中有機磷的含量，間接反映卵磷脂的含量。

2 結果與討論

2.1 蛋黃粉原料成分常規分析

蛋黃粉原料成分的常規分析結果見表1。

表1 蛋黃粉原料成分Table1 The content of egg yolk powder%

2.2 胃蛋白酶濃度對卵磷脂提取的影響

胃蛋白酶的添加量不同，蛋黃粉中蛋白質的肽鍵水解程度不同，蛋白質和脂類的分離受到影響，從而影響了脂類在乙醇的溶解，導致卵磷脂的提取率不同。胃蛋白酶濃度對蛋白質水解程度的影響曲線見圖1。

隨著酶濃度的增加，磷脂的提取率不斷增加。這是由于隨著酶濃度的增加，胃蛋白酶和底物接觸的機會大大增加，在相同時間內水解的分子數也隨之增加，可以使磷脂分離得更快、更徹底。當胃蛋白酶濃度到6.25 mg/mL 時，磷脂的提取率最大。但是，當酶的濃度超過6.25 mg/mL 后，酶濃度的增加對提取率的影響很小。此時酶的濃度超過與底物反應所需酶量，一部分酶分子無底物與之結合，因此提取率隨酶濃度的增加變化不大[5]。為了節約成本和資源，確定胃蛋白酶最佳濃度為6.25 mg/mL。

2.3 溫度對卵磷脂提取率的影響

考察了溫度對卵磷脂產率影響，結果見圖2。

圖2 溫度對卵磷脂提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on lecithin extraction

可以看出，從25℃開始卵磷脂提取率隨溫度的提高而逐漸增加，達到45℃時提取率達到最大，超過45℃反而下降。卵磷脂的提取過程是固-液相之間的擴散過程。當溫度較低時，適當提高提取時的溫度可以增加分子的動能，使溶質擴散的速度加快，從而使提取率增加[6]。但高于45℃后，提取率反而隨溫度升高而下降。提取率下降的原因可能是由于卵磷脂溶于乙醇是放熱反應，卵磷脂的溶解度隨溫度的上升而減少，也可能是溫度升高加速卵磷脂氧化分解。因此在卵磷脂的提取過程中，應該保持一定的溫度范圍，保證卵磷脂有較高的提取率。由圖中可以看出提取卵磷脂的最適溫度在45℃。

2.4 時間對卵磷脂提取率的影響

圖3 時間對卵磷脂產率的影響Fig.3 Effect of time on lecithin extraction

提取時間對卵磷脂提取的影響見圖3。隨著時間的增長，卵磷脂的提取率不斷提高。在30 min 時達到最大。超過30 min 后，卵磷脂提取率有小幅下降之后緩慢上升。這是由于需要提取一定時間后，原料才能全部溶開與乙醇充分結合，從而破壞脂質和蛋白質間的共價鍵，卵磷脂的提取率有所提高。但超過40 min后提取率反而下降，可能是在提取過程中存在卵磷脂的氧化和乙醇揮發，從而影響了卵磷脂提取率。在實驗范圍內卵磷脂最佳提取時間為30 min。

2.5 溶劑濃度對卵磷脂提取率的影響

提取卵磷脂常用溶劑為乙醇，但不同濃度的乙醇提取卵磷脂的效果不同。考察了濃度為60%、70%、90%、95%、100%的乙醇對卵磷脂提取的影響，結果見圖4。

圖4 乙醇濃度對卵磷脂產率的影響Fig.4 Effect of concentration of ethanol on lecithin extraction

可以看出，乙醇濃度在60%到90%時，卵磷脂提取率隨乙醇的濃度升高而升高，在到達90%達到最高；當乙醇濃度超過90%時，隨著乙醇濃度的升高卵磷脂的提取率反而降低。這是由于在乙醇濃度低的時候，溶劑的極性和卵磷脂的極性相差較大，隨著濃度的提高，兩者的性質越來越相似，卵磷脂在乙醇中的溶解度也越來越大，從而卵磷脂的提取率也會隨之增加。但超過90%后時，兩者的性質相差也越來越大，因此卵磷脂的提取率會逐漸下降。所以在保證卵磷脂產率的前提下，考慮原材料、經濟成本綜合因素后選取90%乙醇作為提取蛋黃卵磷脂溶劑。

2.6 溶劑用量對卵磷脂提取率的影響

向一定量的原料液中（原始蛋黃粉5 g）分別加入20 mL、40 mL、80 mL、120 mL、160 mL 乙醇進行提取，溶劑用量對卵磷脂提取率的影響見圖5。

由圖5 可見，乙醇用量在20～80 mL 時卵磷脂的提取率隨乙醇用量增加大幅提高，當達到80 mL，即料液比為1︰16 時卵磷脂提取率最高；但超過80 mL 后，卵磷脂提取率變化幅度不大。這是由于隨著乙醇用量的增加，可以使原料液中的卵磷脂與乙醇融合充分。但是從經濟角度考慮，提取時溶劑用量過大，導致原材料浪費，成本提高，而產率變化不大。因此選用適量的提取劑可以獲得更大的效益。可以看出乙醇最佳用量為80 mL，即料液比為1︰16（g/mL），1 g 蛋黃粉所需要乙醇16 mL。

2.7 正交試驗優選提取工藝

根據單因素試驗的結果，各因素分別選取3 個水平進行酶解超聲輔助提取卵磷脂的正交試驗，其結果見表2。

表2 L9（34）正交試驗因素水平表及極差分析Table 2 Results of L9（34）orthogonal experiments

比較三個因素的極差R

C（乙醇濃度）B（時間）D（料液比）A（溫度）

由表2 可以看出，影響蛋黃卵磷脂提取率的4 個因素的顯著關系從主到次的順序為乙醇濃度、時間、料液比、溫度，酶解超聲輔助提取卵磷脂的最佳工藝為A1B1C1D1，即溫度為35 ℃，反應時間30 min，乙醇濃度為90%，乙醇量為60 mL（料液比為1︰12（g/mL）），此時卵磷脂的提取率最高為80.64%。

3 結論

以蛋黃粉為原料，通過酶解超聲輔助法對蛋黃卵磷脂的提取進行研究。選取了胃蛋白酶的最適添加量，并對超聲溫度、時間、乙醇濃度、料液比進行研究，通過正交試驗對影響卵磷脂的四個因素進行考察，優化卵磷脂提取工藝。酶解超聲輔助法的最佳工藝條件為：酶濃度6.25 mg/mL，超聲頻率35 kHz，溫度為35 ℃，時間30 min，乙醇濃度為90%，料液比為1︰12（g/mL）。此時卵磷脂的提取率為80.64%。

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