超聲波輔助堿法提取芡實蛋白工藝

張曉云，謝玲燕，季明敏，米蘭，董英

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

芡實（又名雞頭米）是一種睡蓮科水生草本植物，廣泛分布于我國南方各地的湖泊、池塘、灘地、水溝中。其味味甘澀性平，是國家衛生部公布的首批“藥食兼用”材料之一。芡實種仁中含有豐富的蛋白質、碳水化合物等基本營養成分，蛋白質的含量與黃花菜、銀耳、木耳等相當[1]，且氨基酸的種類齊全，配比合理，具有較高的藥用價值和營養價值[2]。但到目前為止，對芡實蛋白的提取分離卻很少研究報道。本文通過單因素和正交試驗對芡實蛋白提取條件進行了優化。考慮到芡實壁厚、質地較硬，傳統方法提取蛋白質難以充分擴散出來、提取率低；而采用超聲提取技術具有簡便快速、高效節能、重復性好、不影響提取物的活性等優點[3]。因此在正交試驗優化條件的基礎上，進一步對超聲波輔助提取芡實蛋白質的工藝進行研究，確定了最佳輔助提取工藝參數，為芡實深加工和綜合開發利用提供基礎理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

干芡實：購自蘇州，超微粉碎機粉碎后過120 目篩，烘干備用。

1.2 主要試劑

NaOH（AR）、磷酸（AR 85%）、無水乙醇、考馬斯亮藍G-250 等均購自國藥集團化學試劑有限公司。牛血清白蛋白購自生工生物工程（上海）有限公司。

考馬斯亮藍試劑：稱取100 mg 考馬斯亮藍G-250溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1 000 mL。

標準蛋白質溶液：將結晶牛血清白蛋白用0.15 mol/LNaCl 配制成100 μg/mL 蛋白溶液。

1.3 儀器與設備

WK-1000A 高速藥物粉碎儀：青州市精誠機械有限公司；PHS-3BW 實驗室pH 計：上海理達儀器廠；SHZ-10 組合式水浴恒溫搖床：太倉市實驗設備廠；TGL-16M 高速臺式冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；UV-1601 微量紫外分光光度計：日本島津；GA99-ⅡD 超聲波細胞粉碎機：無錫市上佳生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 芡實蛋白的提取

稱取1.0g 芡實粉，加入一定體積去離子水，40 ℃振搖浸提12 h 后，以1 mol/LNaOH 調節pH，在一定條件下置于水浴搖床上振蕩提取。提取結束后，10 000 r/min離心20 min，收集上清液、定容。

1.4.2 芡實蛋白含量的測定

取定容后的提取液，考馬斯亮藍法（Bradford 法）測定蛋白濃度[4]。根據濃度計算1.0 g 芡實粉所提取的總蛋白的量，以1.0 g 芡實粉所得到的總蛋白量為指標評價提取效果。

1.4.3 芡實蛋白提取條件的選擇

在其它條件相同條件下，分別研究不同pH、料液比、浸提溫度、浸提時間等單因素對芡實蛋白提取的影響。

1.4.4 芡實蛋白提取條件的優化

在單因素試驗基礎上，通過正交試驗對芡實蛋白提取條件進行進一步優化。

1.4.5 超聲輔助提取蛋白工藝

稱取1.0 g 芡實粉，按照1 ∶25（g/mL）的料液比，調節pH 為11 或14，在設定條件下提取。提取結束后，使用φ10 變幅桿，在一定條件下進行超聲波輔助提取，提取時以冰浴降溫。然后4 ℃10 000 r/min 離心20 min。離心結束后，收集上清液，定容待測。

2 結果與討論

2.1 芡實蛋白提取條件的選擇

2.1.1 pH 對芡實蛋白提取的影響

按照芡實粉和去離子水為1：10（g/mL），進行浸提。然后分別調節pH 為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0，在40 ℃條件下進行提取，考察pH 對芡實蛋白提取效果的影響，結果如圖1。

圖1 pH 對芡實蛋白提取量的影響Fig.1 Effects of pH values on extraction of protein

由圖1 可以看出，芡實蛋白在pH 低于10 時，總提取量均很低，而且pH 改變對提取效果基本沒有影響。pH 高于10 時，蛋白提取量隨著pH 升高呈升高的趨勢。pH 超過11，升高趨勢減緩。從pH 13 升至pH14，蛋白提取量升高非常顯著。這是因為溶液pH 的變化，一方面可促進顆粒胞膜的破裂和溶解，增加蛋白質從顆粒中的溶出；另一方面可以改變蛋白質的帶電狀況，直接影響到蛋白質和蛋白質、蛋白質和水之間的相互作用，從而導致蛋白質溶出率的變化[5]。但是蛋白質經強堿性作用后會導致粘度增加，擴散系數降低，而且容易導致蛋白質營養性質的破壞甚至產生毒性[6-7]。綜合考慮，在pH 為11 時提取芡實蛋白較為合適，因此在以下實驗中選用pH11 時優化其它提取條件。

2.1.2 料液比對芡實蛋白提取的影響

在pH11、40 ℃條件下提取，按照芡實粉和去離子水之比（g/mL）分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 進行浸提，結果見圖2。

圖2 料液比對芡實蛋白提取量的影響Fig.2 Efect of solid/liquid ratios on extraction of protein

由圖2 可見，隨著料液比的增加，蛋白總提取量逐漸增大，可能是料液比的增大有利于蛋白質在料液中的溶出。當料液比超過1 ∶25（g/mL）時，蛋白提取總量不再增加。

2.1.3 溫度對蛋白提取的影響

按照芡實粉和去離子水為1 ∶10（g/mL）進行浸提，調節pH 11 后分別在30、40、50、60 ℃條件下提取芡實蛋白，結果見圖3。

圖3 溫度對芡實蛋白提取量的影響Fig.3 Effects of temperature on extraction of protein

由圖3 可以看出，在pH11 時，提取溫度從40 ℃升高到50 ℃，蛋白提取量迅速增加，50 ℃達到最大值。這是由于隨著溫度的升高，蛋白質的溶解度增大，提取率增加。溫度升高到60 ℃時，蛋白提取總量略有降低。可能是溫度過高引起部分蛋白質變性，影響了蛋白質的溶解性，從而使提取率下降，同時會導致蛋白質營養性質的破壞[7]。

2.1.4 提取時間對蛋白提取的影響

按照芡實粉和去離子水為1 ∶10（g/mL）進行浸提。調節pH11 后再分別在40℃條件下提取1、2、4、8、12 h，結果見圖4。

圖4 時間對芡實蛋白提取量的影響Fig.4 Effect of extracting times on extraction of protein

由圖4 可以看出，蛋白提取總量隨著提取時間的增加而增加，在4 h 時達最高。之后隨著提取時間的增加提取總量開始下降，這可能是由于提取時間太長，在提取條件下蛋白開始被降解，同時因為高溫、強堿作用后的蛋白質，其氫鍵被打斷、空間結構被破壞、較多的疏水基團暴露至表面，從而導致蛋白質溶解性改變，最終提取總量降低。

2.2 正交試驗優化谷蛋白提取條件

在上述單因素試驗結果的基礎上，在pH 11 條件下，通過正交試驗對提取時間、料液比、溫度等影響因素進一步優化。正交試驗L9（34）的方案和結果如表1和表2。

表1 試驗因素和水平表Table 1 The factors and levels of otthogonal test

由表2 試驗結果和方差分析可以看出，溫度對芡實蛋白提取影響最大，其實是時間和料液比。各因素影響大小排序為：溫度＞時間＞料液比。根據各因素水平的平均值可以得出的最佳提取條件為A1B2C3。將得到的優選條件與正交試驗中提取量最高的條件A2B2C3同時再做重復驗證實驗。結果A1B2C3條件下的提取量為3 100 μg，而A2B2C3條件下的提取量為3 262 μg。經綜合考慮確定芡實蛋白的最佳提取條件為：芡實按照1 ∶25（g/mL）的料液比浸提后，在pH 11 條件下，50°C提取2 h。

表2 正交試驗結果與方差分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

2.3 超聲波輔助提取芡實蛋白

2.3.1 超聲功率對蛋白提取的影響

在正交試驗優化的最佳條件下提取芡實蛋白，提取結束后設定超聲條件為工作時間2 s，間歇時間4 s，工作總時間3 min，分別設定超聲功率為200、400、600、800 W 進行超聲輔助提取，以考察不同超聲功率對蛋白提取效果的影響，結果如圖5。

圖5 超聲功率對芡實蛋白提取量的影響Fig.5 Effect of Ultrasonic power on extraction of protein

由圖5 可見，隨著功率的增加，蛋白提取量略有增加，這是由于超聲功率增大，空化效應更加劇烈，超聲波對細胞壁的破碎作用增強，蛋白質的溶出速率增加，同時超聲波的空化效應和機械效應也會促進溶劑向芡實顆粒表面擴散，進而促進蛋白質的溶出。考慮到功率太大的經濟成本增加，因此以800 W 作為超聲波輔助提取的設定功率值。

2.3.2 超聲時間對蛋白提取的影響

設定超聲功率為800 W，工作時間為2 s，間歇時間4 s，工作總時間分別設定為5、10、15、20、25 min 進行超聲輔助提取，考察不同超聲時間對蛋白提取效果的影響。結果如圖6。

圖6 超聲時間對芡實蛋白提取量的影響Fig.6 Effect of Ultrasonic time on extraction of protein

由圖6 可見，隨著超聲提取時間的延長，超聲波對原料作用也越充分，蛋白提取量增加。當超聲時間為20 min 時，提取量達峰值，之后開始下降，可能是因為超聲處理時間的過長導致蛋白與其它物質發生反應[8]以及蛋白發生變性，因而水溶性變差的結果。

3 結論

1）在單因素試驗基礎上，通過正交試驗得到芡實蛋白的最佳提取條件為：芡實按照1 ∶25（g/mL）的料液比浸提后，在pH 11 下，50°C 提取2 h。

2）與單一采取堿提法相比，超聲波輔提法不僅可省掉芡實的浸提前處理過程，而且在優化的最佳條件下提取芡實蛋白后，再用超聲波進行輔助提取（設定超聲功率800 W，工作時間2 s，間歇時間4 s，超聲提取20 min），蛋白提取量達8 435 μg，是未超聲時提取量的2.5 倍多。

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