酶法提取金針菇多糖的研究

梁敏，鄒東恢，劉軍

（1.齊齊哈爾大學化工學院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾大學食品學院，黑龍江齊齊哈爾161006）

金針菇[Flammulina velutipes]又名冬菇、樸菇、構菌、青杠菌、毛柄金錢菌，隸屬擔子菌亞門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataceae），金錢菌屬（Flammulina）。金針菇多糖由于具有抑制腫瘤、抗癌、增強肌體免疫力[1-4]等作用而廣泛受到重視，如何提高金針菇多糖的提取率，降低成本已成為拓展金針菇使用范圍、提高應用價值的關鍵。

傳統(tǒng)的浸提法雖然是提取多糖的經(jīng)典方法，但時間長、效率低、能耗大；研究表明中性蛋白酶能有效酶解與多糖結合在一起的蛋白質(zhì)，從而將多糖釋放出來而提高多糖的得率，同時降低了多糖中蛋白質(zhì)的含量，提高了多糖的純度[5]。因此，探索更為高效、經(jīng)濟、可靠的提取方法對金針菇多糖的研究開發(fā)具有重要現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

新鮮金針菇：市售，除去根部，清洗切塊，粉碎，干燥，過40、60、80 目篩，過篩之后把各級金針菇干粉分別裝到清潔干燥的燒杯中，置于真空干燥箱中待用。

木瓜蛋白酶：北京世紀時尚科貿(mào)有限公司；苯酚：天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；葡萄糖：天津市凱通化學試劑有限公司；使用試劑均為分析純。

1．2 儀器與設備

九陽料理機：山東九陽小家電有限公司；THZ-82A型臺式恒溫振蕩器、電熱恒溫水浴鍋、離心機：上海躍進醫(yī)療器械廠；電子天平、SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵、722 型紫外分光光度計、PB-10 型pH 計：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；真空干燥箱：上海益恒試驗儀器有限公司。

1．3 方法與步驟

稱取80 目以上的金針菇干粉5 g，放入到250 mL的三角瓶中，加蒸餾水45 mL 混合均勻后置于50 ℃水浴鍋中，水浴30 min，調(diào)節(jié)pH，稱取木瓜蛋白酶，加入5 mL 蒸餾水溶解，金針溶液放在水浴中預熱至酶解溫度，將酶液加入到金針溶液中，在恒溫振蕩器上提取，反應結束，將三角瓶放到沸水鍋中，10 min 沸水浴滅酶，滅酶結束，冷卻至室溫，將酶提取液放入到離心管中，調(diào)至4 000 r/min 離心，取上清液，即得到酶提取多糖清液。

1．4 葡萄糖標準曲線的制定

以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖。用苯酚-硫酸法測定多糖含量得葡萄糖標準曲線的回歸方程為：0.007 3x+0.015 1，R2＝0.998 6，在0～25 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

1．5 多糖總量的測定

采用苯酚-硫酸比色法[6]，硫酸-苯酚法是以硫酸、苯酚作為顯色劑，與金針菇多糖發(fā)生顯色反應，在490 nm 波長處測定吸光度，再通過已經(jīng)測定的葡萄糖標準曲線計算求得金針菇中的多糖含量。

1．6 蛋白質(zhì)去除方法

采用Sevag 法[7]去除粗多糖中的蛋白質(zhì)。將粗多糖溶液中加入其1/4 體積的氯仿—正丁醇（體積比4∶1），置于具塞試管中，充分搖勻30 min 后用離心機離心10 min，剔去下面的白色渾濁液，取上清液，這樣的操作重復進行3 次～4 次即可除去蛋白質(zhì)。

1．7 多糖的提取

金針菇多糖在水中的溶解度較大，所以先用蒸餾水初步提取，之后取上清液，用體積分數(shù)2%濃度活性炭脫色1 h，加入95%乙醇，使溶液中乙醇的濃度達到75%進行醇沉，醇沉過程中要將其保存在4 ℃冰箱中，保持24 h，4 000 r/min 離心15 min，取沉淀，置于真空干燥箱中干燥，即可得到金針菇粗多糖。

2 結果與分析

2．1 單因素試驗條件確定

2．1．1 物料粒度對金針菇多糖提取率的影響

物料粒度對提取率將有較大影響，將粉碎后的金針菇粉依次通過40、60、80 目篩，取一定量樣品，選擇料液比1 ∶15，溫度50 ℃水浴中浸提1 h，見圖1，金針菇多糖提取率（%）分別為2．8、3.1、3．2、3．3，由此可知80 目以上粒度物料多糖提取率最高，因此試驗選定物料粒度80 目以上。

2．1．2 料液比對金針菇多糖提取率的影響

選擇料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30，分別于50 ℃水浴中浸提1 h，金針菇多糖提取率（%）分別為2．3、3．1、、3．4、3．5、3．5，見圖2，當料液比在1 ∶15～l ∶25之間多糖提取率增長較快，繼續(xù)提高料液比多糖提取率仍有升高，但提高速率減小，因此試驗確定料液比為1 ∶20。

圖1 粒度對金針菇多糖提取率的影響Fig.1 Granularity effects to flammulina veluyipes polysaccharides extraction rate

圖2 料液比對金針菇多糖提取率的影響Fig.2 Liquid-material proportion effects to flammulina veluyipes polysaccharides extraction rate

2.2 金針菇多糖提取的正交試驗

影響枸杞多糖的提取因素很多，通過預試驗選擇其中的4 個優(yōu)化因素作為研究的對象：加酶量、pH、酶解溫度、反應時間，因素水平見表1。

表1 酶提取因素水平表Table 1 Factors and levels forms of enzymatic extraction experiment

采用四因素三水平正交法確定金針菇多糖提取最佳條件，見表2。

先計算每一因素每一水平下實驗指標值的總和，記作K1，K2，K3；平均值，記作k1，k2，k3；以及實驗指標值隨因素水平變化而改變的最大范圍即極差，記作R。比較各因素的極差R，按極差的大小決定因素的主次順序。按極差的大小順序是A＞D＞B＞C，因素的主次順序也為A→D→B→C。

比較每個因素的不同水平下的平均值k1，k2k3，確定最優(yōu)工藝條件。經(jīng)比較4 個因素的不同水平下的各自的平均值，發(fā)現(xiàn)為A3B2C3D3在每個因素的4 個水平下對多糖提取率的提高最大，由此確定多糖的提取率的最優(yōu)條件為A3B2C3D3。

表2 正交試驗結果表Table 2 Orthogonal experiment results

通過正交試驗表可知酶法提取金針菇多糖的最佳工藝條件：為A3B2C3D3即木瓜蛋白酶加量0.6%，酶解溫度55 ℃，pH 為7.0，酶解時間為3 h，提取率提高到7.6%。

3 結論與討論

1）本實驗采用酶法提取金針菇多糖，單因素試驗確定了多糖提取的最佳條件為粒度80 目，料液比1∶20。

2）采用正交試驗確定了金針菇多糖酶法提取的最佳工藝是：木瓜蛋白酶加量0.6%，提取溫度為55 ℃，pH 為7.0，酶解時間為3 h，提取率為7.6%。

3）金針菇多糖來源較穩(wěn)定、高效低毒，是一種極具開發(fā)潛力的生物活性成分，進一步開展金針菇多糖提取、分離純化、結構及藥理實驗研究，對藥物和食品開發(fā)以及金針菇資源的利用都具有重要的意義。目前，有關金針菇多糖的提取主要以水提醇沉法為主，適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，但提取效率低且費時，產(chǎn)品純化困難且活性損失較大。新的提取工藝，如超聲波輔助萃取、微波輔助萃取、酶法提取等已成功用于食用菌多糖的提取，并且顯示出傳統(tǒng)方法無可比擬的優(yōu)勢，相信這些新技術在金針菇多糖的提取方面將具有巨大的應用前景。

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