毛細管電泳-電化學發光法測定腐胺與亞精胺

陳素艷，錢勇強，鄭阿萍，王力

（廈門集美大學生物工程學院，福建廈門361021）

多胺（polyamine，PA）是一類含有兩個或更多氨基的化合物，在生物體內廣泛存在，最常見的多胺包括腐胺（Putrescine，Pu）、亞精胺（Spermidine，Spd）和精胺（Spermine，Spm）。多胺是生物體代謝過程中產生的具有較高生物活性的、低分子量脂肪族含氮堿，具有刺激生長，延緩衰老的作用，并與植物的抗逆性關系密切[1]。適量的多胺有促進組織生長的作用，過量的多胺不僅能加強組胺的毒性，而且還會與亞硝酸鹽反應生成雜環類致癌亞硝胺，引起外部血管膨脹，導致高血壓和頭痛，以及腸道平滑肌的收縮造成腹部痙攣、腹瀉和嘔吐等[2]。亞精胺廣泛分布在生物體內，是由腐胺和腺苷甲硫氨酸生物合成的；腐胺是利用鳥氨酸脫羧而產生的，作為一種腐毒堿存在于腐敗物中，可是也作為生物體的正常成分而廣泛存在著。

目前，分離檢測腐胺和亞精胺的方法有很多種，比如：高效液相色譜法[3]、離子色譜法[4]、酶聯免疫法[5]和毛細管電泳法[6]等。這些方法都有本身的優劣性，高效液相色譜法具有方法快速、靈敏、重現性好等優點，但儀器體積大、不便攜、成本高[7]等；毛細管電泳作為一種高效分離分析技術，因其進樣量小，分離模式多，分析對象廣等優點，已被廣泛應用于各個領域[8]，聯吡啶釕電化學發光作為一種高靈敏、快速的檢測方法，具有較好的時空可控性，在高通量分析中具有潛在應[9]，毛細管電泳（CE）分離-三聯吡啶釕[Ru（bpy）32+]電化學發光（ECL）檢測聯用具有靈敏度高、線性范圍廣、時空可控性好、分離效率高、分析速度快、造價低廉、樣品消耗量少及儀器簡單等優點[10]；劉慧靜等采用毛細管電泳（CE）分離-三聯吡啶釕[Ru（bpy）32+]電化學發光（ECL）檢測聯用技術分離檢測了苦參堿和槐定堿[11]；本實驗選取毛細管電泳-電化學發光法分離檢測葡萄酒中的腐胺和亞精胺。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

MPI-A 型毛細管電泳電化學發光檢測系統（西安瑞邁分析儀器有限責任公司，中國科學院長春應用化學研究所），包括電化學分析儀，數控毛細管電泳高壓電源，多功能化學發光分析儀，多功能化學發光檢測器；未涂層熔融石英毛細管（內徑25 μm×50 cm）：河北永年銳灃色譜器件有限公司；pH211C 型酸度計：北京哈納科儀科技有限公司；Milli-Q Academic 超純水系統：美國Millipore 公司；Sigma 2-16 高速離心機：德國Sigma 離心機公司；CP214 型電子天平：廈門億辰科技有限公司；DHC-9240A 電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；基本型RHK/TC 加熱磁力攪拌器：IKA 儀科，德國；三聯吡啶釕：98%，TCI，日本東京化成工業株式會社；腐胺、亞精胺標準品（98%，J&K，百靈威科技有限公司）；NaH2PO4、Na2HPO4、HClO4（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；NaOH（AR，上海化學試劑總廠）；HCl（AR，上海威海化學有限公司）；實驗用水為超純水，所用溶液需經0.22 μm 醋酸纖維膜過濾；葡萄酒。

1.2 方法

實驗前將毛細管依次用1 mol/L HCl，超純水，0.1 mol/L NaOH 沖洗10 min，然后用運行磷酸鹽緩沖溶液平衡8 h～12 h。檢測池中采用三電極體系，工作電極為Pt 盤電極，為減小溶劑蒸發等因素的影響，每3 小時更換一次Ru（bpy）32+。光電倍增管高壓設為800 V，將毛細管進樣管端插入緩沖液中，待發光信號基線穩定后進樣檢測。

樣品前處理：用0.22 μm 的醋酸纖維濾膜過濾葡萄酒得到待測樣品液，電動進樣后，根據其發光強度及線性回歸方程計算出葡萄酒中生物胺的含量，同時加入一定量的腐胺和亞精胺標準品，進行加標回收率實驗。

2 結果與分析

2.1 檢測條件及毛細管電泳條件的優化

2.1.1 檢測電位的優化

在1.0 V～1.25 V 范圍內研究ECL 強度與檢測電位之間的關系，如圖1（a：2 mmol/L put 的ECL 強度；b：0.5 mmol/L spd 的ECL 強度），在光電倍增管高壓：800 V；進樣條件：10 s×10 kV；運行高壓：15 kV；運行緩沖液：pH8.5，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液；檢測池內Ru（bpy）32+：5 mmol/L（溶于pH8.0 磷酸鹽緩沖溶液條件下進行檢測電位的優化。通過逐漸升高檢測電位，發現在較低檢測電位（如1.05 V）下，腐胺和亞精胺的ECL 強度都相對較弱；當檢測電位升至1.15 V 時，ECL信號強度明顯增加；在檢測電位為1.15 V 時，亞精胺的電化學發光強度達到峰值，而腐胺的電化學發光強度也接近峰值，但是當繼續升高檢測電位，即當電位高于1.15 V 時，腐胺的ECL 強度不再有明顯的升高，同時，亞精胺的電化學發光強度反而呈現明顯的下降趨勢。因此，本試驗的最優檢測電位選為1.15 V。

圖1 檢測電位對ECL 強度的影響Fig.1 Effect of detection potential on the ECL intensity

2.1.2 檢測池中pH 的優化

檢測池中的pH 也是影響ECL 強度的一個因素。以檢測電位1.15 V，運行高壓15 kV，緩沖液濃度為50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液PBS 及pH 為8.5 的條件下，其余均采用系統默認的各項值，改變檢測池中的pH 大小（pH8.00～pH10.00）從而得到ECL 強度與檢測池中pH 的關系，如圖2（a：2 mmol/L put 的ECL 強度；b：0.1 mmol/L spd 的ECL 強度）。

圖2 檢測池中緩沖pH 值對ECL 強度的影響Fig.2 Effect of phosphate buffer pH in detection cell

由圖2 可知，通過逐漸升高檢測池中的pH，發現在pH 為7.0 時，發光性弱且分離差；從pH8.0 開始，亞精胺的ECL 強度以pH9.0 為轉折點先上升后下降，而腐胺的ECL 強度在pH9.0 之前緩慢上升，在pH9.50處達到峰值；綜合考慮，檢測池中的pH 的最優值為pH9.50。

2.1.3 運行高壓的優化

運行高壓對ECL 強度及遷移時間的影響，見圖3。

圖3 運行高壓對ECL 強度及遷移時間的影響Fig.3 Effect of running voltage on ECL intensity and migration time

實驗在檢測電位：1.15V；光電倍增管高壓：800 V；進樣條件：10 s×10 kV；運行緩沖液：pH8.5，50 mmol/L；Ru（bpy）32+：5 mmol/L，pH8.5，50 mmol/L 緩沖液配制的條件下，通過改變運行高壓，從9 kV～17 kV 內研究運行高壓對化學發光強度的影響。結果表明，在運行高壓低時，發光強度也低；運行高壓為13 kV 時，亞精胺的ECL 強度最大，然后又逐漸降低；而腐胺的ECL 強度基本維持在一條水平線上，變化不大，如圖3（a：2 mmol/L put 的ECL 強度；b：0.5 mmol/L spd 的ECL 強度；c：2 mmol/L put 的遷移時間；d：0.5 mmol/L spd）。

運行高壓不僅影響被測物的遷移時間，而且對分離度、峰高都有不同程度的影響。分離電壓越高，遷移時間會越短，但產生焦耳熱增大，導致峰寬和噪聲增大，引起峰形變化。如圖3（c）和圖3（d）所示，當分離高壓在9 kV～17 kV 范圍內變化，腐胺遷移時間從512.50 s變為253.33 s，亞精胺遷移時間由644.57 s 變為308.85 s，均明顯下降；如圖3，在電壓9 kV～15 kV 變化時，亞精胺發光強度先增強，后下降，但總體趨勢仍增強了2 200 多，在電壓從15 kV～17 kV 變化時，發光強度下降，但下降的變化緩慢。而且，當電壓大于13 kV 時，由于毛細管焦耳熱的產生導致了基線噪音變大。另外，大量分析物從毛細管流入檢測池，使得電極表面Ru（bpy）32+的濃度降低，使發光效率下降。而腐胺在實驗范圍內發光強度變化不大。因此，為了獲得較高的發光強度和較短的分析時間，綜合考慮峰寬、靈敏度、噪音、焦耳熱等因素，選擇13 kV 作為運行高壓。

2.1.4 運行緩沖液pH 的優化

在檢測電位：1.15 V；光電倍增管高壓：800 V；進樣條件：10 s×10 kV；運行高壓：13 kV；運行緩沖液：50 mmol/L；Ru（bpy）32+：5 mol/L，pH9.50，50 mmol/L 緩沖液配制條件下，考察pH 在5.0～10.0 范圍內對發光強度的影響。如圖4（a：2 mmol/L put 的ECL 強度；b：0.5 mmol/L spd 的ECL 強度；c：分離度）。

圖4 運行緩沖液pH 對ECL 強度的影響Fig.4 Effect of running buffer running buffer concentration on ECL intensity

由圖4 可知，在pH 較小時，由于胺類物質質子化，發光強度小；隨著pH 的增大，發光強度增大，當緩沖溶液pH 為9.5 時，檢測到腐胺和亞精胺的ECL 強度最高。此后，隨著緩沖液pH 的增加，毛細管內壁的硅羥基充分電離，電滲流增加顯著，腐胺和亞精胺的發光強度明顯減小。為保持較好的分離度和ECL 強度，本實驗將緩沖液的pH 設在9.5。

2.1.5 緩沖液濃度的優化

在檢測電位：1.15 V；光電倍增管高壓：800 V；進樣條件：10 s×10 kV；運行高壓：13 kV；運行緩沖液：50 mmol/L；Ru（bpy）32+：5 mmol/L，pH9.50，50 mmol/L 緩沖液配制條件下，考察緩沖液濃度在20 mmol/L ～70 mmol/L 范圍內對發光強度的影響。如圖5（a：2 mmol/L put 的ECL 強度；b：0.5 mmol/L spd 的ECL 強度；c：分離度）。

圖5 運行緩沖液濃度對ECL 強度的影響Fig.5 Effect of buffer concentration on ECL intensity

由圖5 可知，腐胺的ECL 強度先增強，在50 mmol/L處達到峰值，然后隨著緩沖液濃度的增加，發光強度開始下降；亞精胺也是隨著緩沖液濃度的增加，ECL強度以40 mmol/L 處為峰值先增強，后下降，但在50 mmol/L 總體趨勢仍增強了1 200 多。另外，實驗也考察了分離度，在40 mmol/L～60 mmol/L 處幾乎處于水平位置，影響不大；綜合考慮分離度和ECL 強度等因素，故選擇50 mmol/L 作為緩沖液濃度。

2.2 最低檢測限、線性及精密度

在最佳條件：檢測電位1.15 V，Ru（bpy）32+濃度5 mmol/L，pH9.5；進樣條件10 s×10 kV，分離高壓13 kV，分離緩沖液為pH9.5，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液下，對腐胺和亞精胺與ECL 強度之間的校準曲線及最低檢出限進行測定，并驗證此方法的精密度，所得結果令人滿意，見表1。

表1 方法的線性和檢出限Table 1 The linearity of the method and detection limit

2.3 樣品測定

將自制葡萄酒用0.22 μm 濾膜過濾，采用上述全部的優化條件來對處理后的自制葡萄酒進行測定，進樣檢測，見圖6。

從圖6 可以看出，葡萄酒樣品中的雜質不干擾腐胺和亞精胺的測定，因此，用CE-ECL 法可直接測定該自制葡萄酒樣品中的腐胺和亞精胺的含量。由實驗測得，該自制葡萄酒中亞精胺的含量為0.143 mmol/L，未測出腐胺。

取待測液4 份，其中1 份為未加內標樣品待測液，其它3 份用于進行加標回收率實驗，分別向3 份待測液添加5、10、15 μL 亞精胺標準溶液作為內標。在最佳實驗條件下，對這4 份樣品進行檢測。對未加內標樣品液進行平行測定，其遷移時間和峰高的相對標準偏差（RSD）分別為0.13%和7.29%。對加標樣品的實驗結果見表2，回收率在誤差范圍內，效果較好。

表2 葡萄酒中亞精胺的含量及其加標后的回收率檢測結果Table 2 Content of the wine spermidine and after prevented the recovery test results

3 結論

本文闡述了一種用毛細管電泳和電化學發光結合的方法對葡萄酒樣品中的腐胺與亞精胺含量進行測定，對各種影響分離和檢測的條件進行了細致研究。在最佳實驗條件下，腐胺的最低檢出限（S/N=3）為0.1 mmol/L，線性范圍0.1 mmol/L～4 mmol/L，線性相關系數r=0.994 9；亞精胺的最低檢出限（S/N=3）可達0.05 mmol/L，線性范圍0.05 mmol/L～2 mmol/L，線性相關系數r=0.992 5，9 min 可完成檢測。利用此法對腐胺和亞精胺進行分離檢測具有高效、高靈敏度、樣品消耗少及操作成本低的優點，是檢測食品中腐胺和亞精胺含量的可行方法。

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