蜂蜜中四環素類抗生素的放射免疫法檢測

周浩，李俊霞，楊紅，肖全偉，葉梅，萬渝平

（成都市產品質量監督檢驗院，四川成都610041）

四環素族抗生素（Tetracyclines，TCs）是由鏈霉菌產生的一類廣譜抗生素，主要包括四環素（Tetracycline，TC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）、金霉素（Chlortetracyline，CTC）等，由于其價格低廉，已被廣泛應用于畜禽、水生動物和蜜蜂養殖中[1-2]。蜜蜂養殖過程中，主要用于防治蜜蜂幼蟲感染的腐臭病[3]，因而可能造成蜂產品中四環素類抗生素的殘留。蜂蜜是人們非常喜歡的一類食品，長期食用受四環素類抗生素殘留的蜂蜜會嚴重危及人類的身體健康，四環素類藥物的毒性反應主要表現在對胃、腸、肝、腎的損害以及對牙齒和骨骼的破壞，最顯著的殘留毒性是誘導耐藥菌株的產生[3-4]。目前四環素類抗生素的檢測方法有微生物法、酶聯免疫法、高效液相色譜法和質譜連用法[3]等，雖然這些方法都準確可靠，但前處理繁瑣復雜，檢測時間較長，遠不能滿足大批量樣品快速檢測的需要；因此需要準確快速的方法來篩檢蜂蜜中四環素族抗生素殘留，從而縮短陰性樣品的檢測時間，旨在建立了一種快速、準確、可靠的放射免疫法用于蜂蜜中四環素類抗生素的日常檢測。

1 材料與方法

1.1 設備與材料

1.1.1 儀器和設備

Charm II 7600 分析儀、電熱恒溫器（THERMO M3760-33）、渦旋振蕩器（INCTRONTC.2）專用硼硅玻璃試管及試管塞：美國CharmⅡ公司產品；離心機（GEMANY ROTOFIX 32A），精密pH 試紙（5.0～10.0），微量移液器等。

1.1.2 試劑

四環素類抗生素檢測試劑盒及閃爍液，提取緩沖溶液（Extraction Buffer），多抗標準品，調節pH 緩沖液、陰性組織提取物，以上試劑均由Charm 公司試劑盒提供。

1.1.3 四環素類標準品

四環素、土霉素、金霉素，氯霉素、恩諾沙星、新霉素、慶大霉素、鏈霉素、螺旋霉素、磺胺二甲嘧啶、紅霉素、青霉素G 等標準品：Sigma 公司。

1.1.4 試驗樣品

市場購買蜂蜜20 組，四環素類抗生素陽性留檢樣品10 組及陰性樣品40 組。

1.2 方法

1.2.1 測試原理

放射免疫法原理基于兩個方面，其一：每類抗生素族均是在一個母環基礎上用不同的功能團修飾形成特定功效的抗生素。其二，微生物細胞表面都存在著能與抗生素功能基團結合的特異受點[5]。Charm II 放射免疫分析法測定使用兩種試劑：一種是被[3H]標記的四環素，另一種是四環素抗生素結合試劑（微生物細胞上的特異性受體）。當樣品中含有四環素類抗生素殘留時，殘留物與結合試劑受體上的結合位點結合，從而阻止了[3H]標記的四環素與結合位點的結合。[3H]標記的四環素結合越多，則樣品中四環素類抗生素殘留越少。用液體閃爍計數儀測定樣品中的[3H]的cpm （count per minute 每分鐘脈沖數）值，cpm 值越大，樣品中的四環素類抗生素殘留量越低[5-7]。

1.2.2 樣品制備

稱取1 g 蜂蜜于做好標記的帶蓋樣品管，加10 mL提取緩沖液至樣品管中，旋渦振蕩15 s。如果蜂蜜有結晶，可置于不超過60 ℃的水浴中溫熱，振蕩，待樣品全部溶解后，迅速冷卻至室溫。用pH 試紙測試pH，滴加調節pH 緩沖液緩沖液，直到將pH 調至7.5，此液為待測液。

1.2.3 測定步驟

取出檢測試劑盒，用壓桿將白色藥片（微生物受體）推出到空的試管中；用加液器取300 μL 溫水至管中，用旋渦振蕩混合10 s 將藥片打碎；用移液器加5 mL 樣品，接著將橙色藥片（[3H]標記的四環素抗體）推至試管中；用混合器混合15 s；在36 ℃的孵育器孵育5 min；將離心機調至4 000 r/min 離心5 min；立即小心棄去上清液，用吸水物將測試管邊緣的水珠擦干；加300 μL 溫水，用旋渦振蕩混合10 s 將沉淀物打碎；加3 mL 閃爍液至試管中，加蓋，混勻，靜置1 min。在Charm II 7600 分析儀的[3H]頻道進行60 s 計數，將測得結果與控制點比較，如果樣品cpm 值大于控制點，則判定為陰性；如果樣品cpm 值小于或等于控制點，應判定為初篩陽性。

1.2.4 控制點的確定

按照GB14963-2003《蜂蜜衛生標準》的要求，蜂蜜中四環素族抗生素殘留量應不大于50 μg/kg，因此應選陰性樣品加標濃度為50 μg/kg 作為控制點。首先用LC-MS 方法確定6 組蜂蜜中四環素類殘留陰性樣品，在6 份陰性樣品中分別加入標準品，形成樣品中四環素類含量50 μg/kg，按照1.2.2 中進行提取，1.2.3 的步驟進行測定，得出6 個cpm 值，計算其平均值。考慮提取過程中的回收以及防止假陰性出現，因此控制點的cpm 值確定在平均值的基礎上上調10%，即控制點cpm 值＝平均值×（1＋10%）。

1.2.5 陽性結果的確定

當樣品cpm 值小于控制點cpm 值時，應首先同時測定一個陰性質控和一個陽性質控，以確定試劑和設備是否工作正常，測試的陽性質控應該小于控制點。再重新取樣平行測定，如果重測樣品的cpm 小于控制點，且試劑和設備正常，則判定樣品初篩陽性，改用LC-MS 法進行確定。

1.2.6 交叉反應

分別將氯霉素、環丙沙星、鏈霉素、青霉素G、阿莫西林、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、紅霉素、螺旋霉素標準儲備液，添加到陰性樣品中，配成含單一抗生素以及多種抗生素濃度為1 000 μg/kg 的蜂蜜樣品，樣品處理及檢測方法同1.2.2 和1.2.3。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

將金霉素標準品添加入四環素陰性蜂蜜樣品中，使添加后蜂蜜中金霉素的濃度分別為20、50、80、100、150、200、250、300、350、400 μg/kg，按1.2.3 節測定步驟檢測其cpm 值，結果見圖1。

圖1 金霉素標準曲線Fig.1 Standard curve of CTC

由于在Charm II 放射免疫分析中作為受體的細菌和被[3H]標記的抗原的量是固定的，因此當樣品中競爭性抗原濃度增加時其競爭效率下降，表現在圖上就是曲線趨于平緩。

2.2 加標試驗

用50 μg/kg 篩選水平，陰性樣品分別添加四環素，土霉素，金霉素以及它們混合標準，混標1：（土∶四∶金=4∶3∶3），混標2：（四∶土∶金=4∶3∶3），混標3：（金∶土∶四=4∶3∶3），結果見表1。

從表1 可以看出，無論是單標還是混標，在50 μg/kg篩選水平實驗中篩選結果均為陽性。

2.3 比對試驗

在對用LC-MS 法檢測結束的50 組留檢樣品，其中四環素類抗生素（總量大于50 μg/kg）陽性留檢樣品10 組及陰性樣品40 組，用charm II 放射免疫法檢測，結果見下表2。

表2 放射免疫法與LC-MS 法對50 組樣品檢測結果Table 2 The radioimmunoassay and LC-MS method deter mination result of 50 group samples

2.4 應用檢測

以50 μg/kg 作為篩選水平，對20 組市場購買的蜂蜜進行篩選，其結果見表3。

表3 蜂蜜中四環素類抗生素殘留測定Table 3 Determination of tetracycline antibiotics residues in Honey

用LC-MS 方法驗證4、8、17 號樣品的四環素類殘留總量結果分別為121.3、60.6、184.1 μg/kg。同時驗證其余陰性樣品，測定結果均小于50 μg/kg。表明應用情況良好，篩選結果可靠。

2.5 交叉反應

對1.2.6 中其它族抗生素的反復加標試驗，與控制點比較cpm 值，結果均為陰性。表明charm II 放射免疫分析法特異性強，結果準確可靠，與本族以外的抗生素無交叉反應。

3 小結

目前在日常檢測中陽性樣品相對于陰性樣品很少，因此檢測發展的趨勢之一就是快速區分陽性與陰性樣品。Charm II 放射免疫分析法是結合微生物學與免疫學各自特點發展起來的，該方法已經被美國FDA認可；主要應用于食品抗生素殘留的初篩[7]。放射免疫檢測法最突出的優點是操作簡單、速度快、分析成本低，特別適用于大量樣品的篩選，從接收樣品到出結果，整個過程大約20 min。一個陰性結果不但表明該樣品中含四環素族單種抗生素濃度分別小于50 μg/kg，同時也可表示為四環素族濃度總和不超過50 μg/kg。所以，Charm II 放射免疫法檢測，提供了一種很好的蜂蜜中多種四環素類抗生素檢測的快速篩選方法。

[1] 李俊所,邱月明,王超.獸藥殘留分析[M].上海:上海科學技術出版社,2002:369-369

[2] 賈久滿,要瑞莉,朱蓮英.我國動物性產品中抗生素殘留問題的現狀及對策[J].安徽農業科學,2007,35(7):1368-1370

[3] 閆小峰.四環素類抗生素殘留檢測方法研究進展[J].中國獸藥雜志,2010,44(5):47-50

[4] 杜紅鴿,郭芙蓉,陳薔.四環素類藥物殘留分析方法研究進展[J].河南畜牧獸醫：綜合版,2008,29(6):13

[5] 王晶,王林,黃曉蓉.食品安全快速檢測技術[M].北京:化學工業出版社,2002：41-56

[6] 鄭晶,黃曉蓉,林杰,等.應用放射免疫分析方法快速篩檢烤鰻中四環素族藥物殘留[J].福建水產,2005(3):47-49

[7] 陸勤,林峰,張美金,等.牛奶中四環素類抗生素放射免疫檢測方法驗證分析[J].中國獸藥雜志,2007,41(5):37-39