一株乳酸菌發酵條件優化及檢測方法的建立

苑廣志

（遼寧農業職業技術學院，遼寧營口115009）

乳酸是重要的生物化工產品，廣泛用于醫藥、食品、飲料、日用化工、石油化工、皮革、卷煙工業等領域[1-4]。特別是近年來開發出的L－乳酸的聚合物，可生產生物降解的農用地膜及其它塑料制品代替無法降解的常用塑料，能解決全球的“白色”污染問題[5-6]。乳酸有廣闊的國內外市場。

目前乳酸的生產方法主要有化學合成法，酶法[7]和發酵法。化學合成法由于所用的原料是乙醛和劇毒物質氫氰酸，因而合成法生產乳酸大大受到限制，其生產成本也較高。酶法生產乳酸雖然可以專一性得到旋光乳酸，但工藝比較復雜，應用到工業上還有待于進一步研究。微生物發酵法生產乳酸，可通過菌種和培養條件的選擇而得到具有專一性的D 乳酸、L－乳酸或是DL－乳酸。且乳酸菌具有發酵溫度高，產酸率相對較高，對糖利用率高，發酵時不需通氧氣等優點，因此發酵法具有非常廣闊的前景[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種

耐堿菌：LP3－3，中科院微生物研究所提供。

1.1.2 主要儀器

P/ACE MDQ 毛細管電泳儀：Beckman 公司（美國），配有二極管陣列檢測器；熔融石英毛細柱：40 cm（有效長度為37 cm×50 μm I.D）；ZD-2 自動電位滴定儀、UV2450 紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；TJL-16G 臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；THZ-82（A）數顯水浴恒溫振蕩器：金壇市順華儀器有限公司廠；LRH-150 生化培養箱、ZHWY-211C 恒溫培養振蕩器、ZHJH-1112 垂直流超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；XS-212 生物顯微鏡：重慶光學儀器廠。

1.1.3 主要試劑

試劑：磷酸（大于85%）；十六烷基三甲基溴化胺；蘋果酸；琥珀酸；草酸；檸檬酸；酒石酸；甲酸；乙酸；丙酸；乳酸。以上各有機酸均為分析純。

1.1.4 培養基

培養基1 000 mL 中各營養成分比例如下（單位：g）：葡萄糖50.0，胰蛋白胨2.0，酵母膏10.0，蛋白胨4.0，乙酸鈉（無水）2.0，檸檬酸三銨2.0，K2HPO4·H2O 2.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnCl2·4H2O 0.05，吐溫-80 1，NaCl 40，用10%的Na2CO3調pH，初始pH 為9.0。滅菌條件為110 ℃，25 min。

1.2 方法

1.2.1 發酵條件的優化

分別對該菌株的發酵條件如接種量、pH、溫度進行優化。

1.2.1.1 接種量對發酵的影響

用較大的接種量可以縮短延遲期，從而縮短發酵周期，但有時也會造成菌體的早衰，導致發酵后勁不足。這里分別使用1%、3%、5%、8%、10%的接種量以優化后的發酵培養基采用35 ℃，200 r/min，恒溫振蕩培養48 h，定期取樣品測定OD600值及乳酸的產量。

1.2.1.2 初始pH 的優化

培養基的初始pH 會影響菌體的生長和代謝流的分布，在1.2.1.1 試驗基礎上分別對初始pH 為6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0 的優化發酵培養基在35 ℃，200 r/min，恒溫振蕩培養48 h，定期取樣品測定OD600值及乳酸的產量。

1.2.1.3 溫度的優化

溫度對菌體生長和酶的活性有顯著影響，因此在1.2.1.2 試驗基礎上分別對培養溫度為20、25、30、35、40 ℃的菌株的發酵情況進行測定。

1.2.2 乳酸的檢測

1.2.2.1 毛細管電泳的操作條件

分離電壓：負電壓，8 kV；壓力進樣：3.45×103Pa，時間6 s；柱溫：25 ℃；紫外檢測波長：200 nm；為優于進樣，2 次進樣之間用0.5 mol/L NaOH 水溶液沖洗2 min，再用雙蒸水沖洗2 min，最后用500 mmol/L磷酸緩沖液沖洗2 min。

1.2.2.2 毛細管電泳的檢測方法

用去離子水分別配制1 g/L 的蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、草酸、甲酸、乙酸、丙酸、乳酸標準溶液。將各有機酸標準溶液在相同的電泳條件下依次進行分析，得到各有機酸的遷移時間，依次來決定混合標準液中各個物質的出峰順序。在1.2.2.1 的操作條件下，以各有機酸的峰面積A 對濃度C 進行線性回歸，得到各物質的線性回歸方程并繪制出標準曲線。在相同的色譜條件下測定發酵液中乳酸的含量。

1.2.2.3 實際發酵液樣品的檢測

將實際發酵液在8 000 r/min 轉速下離心20 min，取上清液經0.22 μm 針筒式水膜過濾器過濾后，直接取樣進行檢測。

1.2.3 測定方法

菌液OD：采用UV2450 紫外分光光度計在600 nm下測定；乳酸檢測：采用毛細管電泳法。

2 結果與分析

2.1 發酵條件對于乳酸產量的影響

2.1.1 接種量對乳酸產量的影響

接種量對乳酸產量的影響試驗結果如圖1。

由圖1 可以看出：接種量小于5 %時，隨著接種量的增加，產生的乳酸量也在相應增加，但當接種量超過5 %后，乳酸量反而下降，說明采用較大的接種量可以縮短菌體繁殖達到高峰的時間，但如果接種量過多，往往使菌體生長過快過多，營養物質迅速消耗，菌體早衰，造成發酵后勁不足，從而影響產酸量；而接種量過小，除了延長發酵周期外，往往還會引起其它不正長常的情況。綜合以上因素確定采用接種量為5 %。

2.1.2 初始pH 對乳酸產量的影響

發酵過程中培養液的pH 是菌體在一定環境下代謝活動的綜合指標，是一個重要的發酵參數，它對于菌體的生長和產品的積累有很大的影響。初始pH 對乳酸產量的影響試驗結果如表1 和圖2 所示。

表1 初始pH 對乳酸菌生長的影響Table 1 Effect of pH on growth of LP3-3

由表1 可知，隨著初始pH 的增加，菌體的生長速率逐漸變快，而初始pH6～8 時，菌體只有少量生長；從時間來看符合菌種生長的趨勢，即在24 h 已處在穩定期，從24 h～34 h 是積累代謝產物的過程。從圖2 中可以看出：初始pH6～8 時，只有少量乳酸產生，而從24 h～34 h，初始pH 為9，10，11 的發酵液中的乳酸量都在相應增加，且pH9 的乳酸產量明顯高于其他。綜合以上數據選擇初始pH 為9。

2.1.3 溫度對乳酸產量的影響

溫度是影響有機體生長與存活的最重要因素之一。它對生活機體的影響表現在兩方面：一方面隨著溫度的上升，細胞中的生物化學反應速率和生長速率加快；另一方面，機體的重要組成如蛋白質、核酸等對溫度都比較敏感，隨著溫度的增高而可能遭受不可逆的破壞。在最適溫度下，菌種可以獲得最佳的生長效果，在最適溫度下，也可獲得最佳的產物量，因此確定發酵的最適溫度，對提高乳酸產量至關重要。試驗結果如圖2 和表2 所示。

表2 溫度對菌體生長的影響（34 h）Table 2 Effect of temperature on grow of LP3-3

由表2 可知，30 ℃、35 ℃菌體的生長較好，且30 ℃是其最適生長溫度，而25 ℃、40 ℃其生長受抑制。綜合圖3 可以得出結論：盡管30 ℃是其最適生長溫度，但其產酸最適溫度為35 ℃。因此采用35 ℃作發酵溫度，而30 ℃作為種子培養溫度。

2.2 乳酸檢測方法的建立

2.2.1 毛細管電泳操作條件的選擇

2.2.1.1 檢測波長的選擇

在全波長范圍內掃描發現，9 種有機酸在200 nm左右都有最大吸收，為得到均衡的靈敏度，實驗選擇200 nm 為檢測波長。

2.2.1.2 操作電壓的影響

改變電壓從6 kV～12 kV，9 種有機酸的遷移時間逐漸減少。此外，隨著電壓的增大，電泳電流增加，各峰峰形變的尖銳，分離效率提高，但產生的焦耳熱增多，導致區帶增寬，分離度下降。因此選擇電壓為8 kV。

2.2.1.3 進樣時間的影響

固定3.45×103Pa 壓力進樣，3 s～10 s 區間改變進樣時間。進樣時間越長，靈敏度越高，但溶質區帶加寬，分離度降低；然而進樣時間越短，會使峰電流響應太小，峰高重現性得不到保證。故選擇進樣時間為6 s。

2.2.1.4 電泳溫度的影響

考察了15 ℃～30 ℃間9 種有機酸的分離情況。結果表明，隨著溫度的升高，電流增大，遷移時間縮短，但同時會產生更多的焦耳熱，導致分離度下降。為了兼顧分析時間和分離度，選擇電泳溫度為25 ℃。

2.2.1.5 緩沖液濃度對有機酸分離的影響

分別用不同濃度（400 mmol/L、500 mmol/L、600 mmol/L）的磷酸緩沖液對9 種有機酸進行分離，實驗發現，3 種濃度的緩沖液對遷移時間的影響不大，但當濃度增大為600 mmol/L 時，9 種有機酸的分離效果不太理想，前2 種有機酸重合在一起，沒有分離開，而且還有一種有機酸在此濃度下沒有信號，如圖4 所示。

由圖4 可知，在400 mmol/L 和500 mmol/L 濃度條件下，9 種有機酸分離較好，因此，本實驗選擇濃度為400 mmol/L 和500 mmol/L 均可。

2.2.1.6 緩沖液pH 對有機酸分離的影響

有機酸為弱酸，其pKa值大多在2～6 之間，因此有機酸的有效遷移率的大小在很大程度上取決于緩沖液的pH。在緩沖液pH分別為5.50、5.75、6.00、6.25、6.50 的條件下，對9 種有機酸進行分離，實驗結果見圖5。

由圖5 可知，當pH 小于6 時，這幾種有機酸不能完全分離，因此最終選取pH 為6.25。

2.2.2 有機酸的定性與定量分析

2.2.2.1 有機酸的定性分析

將各有機酸標準溶液在相同的電泳條件下依次進樣分析，得到各有機酸的遷移時間，與混合標準液進樣后的譜圖比較，從而確定各種有機酸的出峰順序，見圖6。

由各標準有機酸的遷移時間可得到出峰順序依次為：蘋果酸、甲酸、琥珀酸、草酸、酒石酸、檸檬酸、乙酸、丙酸、乳酸。其中乳酸標準品的譜圖見圖7。

2.2.2.2 有機酸的定量分析

在最優化的色譜操作條件下，以各有機酸的峰面積A 對濃度C 進行線性回歸，得到各物質的線性回歸方程及線性范圍、相關系數。定量參數見表3。

表3 各有機酸的定量參數Table 3 Analytical characteristics of the method

由表3 可見無論從定量精度還是靈敏度均可滿足分析要求。

2.2.3 實際發酵液樣品的檢測

將實際發酵液在8 000 r/min 轉速下離心10 min，取上清液經0.45 μm 針筒式水膜過濾器過濾后，直接取樣100 μL 進行檢測。實際樣品檢測結果見圖8 及圖9。

從圖中也可看出隨著時間推移，乳酸的含量逐漸增多，同時伴有其他有機酸的代謝。而且整個分離過程在10 min 內基本完成，所以此方法完全可用于微生物發酵生產有機酸過程中的在線監測。

3 結論與展望

1）通過單因素試驗，確定了搖瓶發酵最佳條件為：接種量為5%，溫度為35 ℃，初始pH 為9.0。

2）出發菌種產乳酸為10.019 g/L，而在最佳發酵條件下，34 h 產乳酸量為16.267 g/L，比原來提高乳酸產量62.4%，達到了較好的篩選效果。

3）建立了毛細管電泳檢測乳酸的方法。即操作條件為檢測波長為200 nm，操作電壓為8 kV，進樣時間為6 s，電泳溫度為25 ℃，磷酸緩沖液濃度為400 mmol/L或500 mmol/L，pH 為6.25，為整個分離過程在10 min內基本完成，此方法完全可用于微生物發酵生產有機酸過程中的在線監測。

4）本論文僅對乳酸的產生進行了監測，今后可以對該菌產生的其它有機酸的代謝進行監測，用代謝組學的方法來研究該菌的代謝途徑，代謝通量等，從而提高其產乳酸的能力。

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